目的:制備抗水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）主要衣殼蛋白ORF40的單克隆抗體,對該蛋白在VZV感染細胞內(nèi)的表達、分布以及在VZV病毒顆粒中的包含情況進行初步探究。方法:設計并合成VZV ORF40多肽片段,偶聯(lián)牛血清白蛋白后免疫小鼠,制備與篩選抗VZV ORF40單克隆抗體,使用獲得的抗體通過Western blot和免疫熒光法對VZV感染細胞進行檢測,并通過Western blot對純化的VZV病毒顆粒進行檢測。結(jié)果:獲得VZV ORF40單克隆抗體10F2,該抗體可特異性識別VZV感染細胞表達的以及VZV病毒顆粒包含的ORF40蛋白;本研究應用該抗體確定了ORF40蛋白在VZV感染細胞中的核定位,并且發(fā)現(xiàn)ORF40蛋白在核周有點狀聚集現(xiàn)象,在細胞質(zhì)區(qū)域偶爾也能檢測到ORF40蛋白的分布。結(jié)論:本研究篩選獲得抗VZV ORF40的特異性單克隆抗體,為后續(xù)開展該蛋白在VZV感染與病毒顆粒組裝過程中的功能研究奠定基礎。 

【文章來源】：中國免疫學雜志. 2019,35(09)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

抗VZV-OＲF40單克隆抗體10F2性質(zhì)鑒定Fig．1Characterizationofanti-VZV-OＲF40mAb10F2

圖2OＲF40在VZV感染細胞中的表達與亞細胞定位Fig．2ExpressionandsubcellularlocalizationofOＲF40inVZV-infectedcellsNote:A.WesternblotofcellextractsofAＲPE-19cellsuninfectedorinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.1.UninfectedAＲPE-19cells;2.AＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOka.B.ImmunofluorescenceanalysisofAＲPE-19cellsuninfectedorinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.2.2VZV感染細胞中OＲF40的Westernblot及免疫熒光檢測收集VZVpOka感染48h后的AＲPE-19細胞及未感染的AＲPE-19陰性細胞，分別裂解后使用單抗10F2對其進行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，單抗10F2與VZVpOka感染的AＲPE-19細胞裂解液發(fā)生特異性反應，且不與未感染的AＲPE-19細胞發(fā)生反應，其檢出的蛋白條帶在130～180kD之間，約為153kD(圖2A)，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達的OＲF40蛋白(圖1A)以及理論大小一致。進一步使用單抗10F2對VZVpOka感染48h后的AＲPE-19細胞及未感染的AＲPE-19陰性細胞做免疫熒光檢測。結(jié)果顯示，單抗10F2同樣與VZV感染的AＲPE-19細胞發(fā)生較強的特異性反應，且發(fā)現(xiàn)與單獨外源表達的OＲF40細胞質(zhì)定位不同，本實驗檢出的OＲF40蛋白絕大部分定位于細胞核內(nèi)，呈彌散分布或者在核周呈點狀分布(圖2B，白色箭頭)，部分細胞的細胞質(zhì)內(nèi)也能檢測到OＲF40(圖2B，綠色箭頭)，這樣的定位變化可能是由于OＲF40蛋白和其他病毒蛋白相互作用，共同參與細胞核內(nèi)的衣殼組裝而引起的。同時，單抗10F2與未感染的AＲPE-19細胞沒有任何非特異性反應。2.3VZV衣殼中OＲF40蛋白的Westernblot檢測為進一步探究單抗10F2是否可用于對VZV衣殼中OＲF40蛋白的檢測，本研究通過蔗糖密度梯度離心法從VZV感染的AＲPE-19細胞中初步純化獲得VZV衣?

畝ㄎ槐浠?贍蓯怯捎贠ＲF40蛋白和其他病毒蛋白相互作用，共同參與細胞核內(nèi)的衣殼組裝而引起的。同時，單抗10F2與未感染的AＲPE-19細胞沒有任何非特異性反應。2.3VZV衣殼中OＲF40蛋白的Westernblot檢測為進一步探究單抗10F2是否可用于對VZV衣殼中OＲF40蛋白的檢測，本研究通過蔗糖密度梯度離心法從VZV感染的AＲPE-19細胞中初步純化獲得VZV衣殼顆粒，通過銀染(圖3A)和透射電鏡(圖3B)分析可見獲得的VZV衣殼純度較好。隨后，通過Westernblot分析發(fā)現(xiàn)(圖3C)，OＲF40蛋白與另一種小衣殼蛋白OＲF23均能在純化的VZV衣殼中圖310F2可用于VZV衣殼中OＲF40蛋白檢測Fig．3DetectionofOＲF40containedinVZVcapsidsusingmAb10F2Note:A.SilverstaininganalysisofpurifiedVZVcapsidsandcellextractsofAＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2;B.TransmissionelectronmicroscopyofpurifiedVZVcapsids;C.WesternblotanalysisofpurifiedVZVcapsidsandcellextractsofAＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOkausinganti-VZV-OＲF40mAb10F2.1.PurifiedVZVcapsids;2.AＲPE-19cellsinfectedwithVZVpOka;M.Proteinmarker.檢出，且無法檢出病毒囊膜蛋白(如gE)，也基本不包含細胞成分(如β-tubulin)，而以上蛋白在VZV感染細胞裂解液中均能檢出。該結(jié)果證明，單抗10F2對VZV衣殼中OＲF40蛋白同樣具有高效且特異的識別能力。3討論VZV的有效擴散依賴于大量感染性病毒顆粒的產(chǎn)生，而高度有序的病毒衣殼蛋白元件的合成與衣殼組裝是VZV感染與制周期的關鍵步驟，為設計抗病毒藥物提供了良好靶標。雖然通過HSV-1的同源推測已經(jīng)大致確定了VZV衣殼蛋白的種類及功能，但是關于VZV衣殼蛋白的性質(zhì)、功能、蛋白-蛋白相互作用及其組裝機制仍缺少研究報


本文編號：3341646