發(fā)布時間：2017-04-29 02:07

  本文關(guān)鍵詞：軍團菌Ⅳ型效應因子RidL的結(jié)構(gòu)生物學研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：嚴重感染嗜肺型軍團菌(Legionella pneumophila)后,可能會發(fā)展成軍團菌病(Legionnaires'disease)。在嗜肺型軍團菌通過內(nèi)吞作用進入宿主細胞后,利用自身Icm/DotⅣ型分泌系統(tǒng)分泌RidL效應蛋白分子。RidL定位于LCV囊泡膜上,通過與逆向運輸復合物(Retromer complex)中的Vps29亞基相互作用,改變逆向運輸復合物的功能,從而影響宿主的逆向膜泡運輸通路,進而利于細菌在LCV中繁殖。然而RidL和Vps29詳細的相互作用方式以及RidL的調(diào)節(jié)機理都不清楚。 為了回答上述問題,本文利用大腸桿菌表達系統(tǒng),表達RidL(183-734)一段截短序列。經(jīng)過多個純化步驟,包括親和純化、離子交換層析、分子篩層析等,得到純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定、均一且適合進行晶體學研究的蛋白樣品,最終濃縮到20mg/ml。經(jīng)過初步篩選、后續(xù)優(yōu)化等多步探索和嘗試,本文得到了RidL(183-734)單個蛋白的晶體,經(jīng)過X衍射處理,native晶體可以得到分辨率達2.7A的數(shù)據(jù)。用代謝缺陷型菌株B834,我們表達并純化得到了RidL(183-734)硒代衍生物的蛋白,并優(yōu)化得到其晶體,其X衍射分辨率可達3.5A。native和硒代衍生物晶體經(jīng)初步晶體學分析可確定其空間群為C2。晶胞參數(shù)為：a, b, c (A):259.64,78.394,70.07; α,β,γ(°):90.00,91.49,90.00。本文用分子、生化、結(jié)構(gòu)等方法,首次得到RidL晶體學數(shù)據(jù),探索了一系列對RidL結(jié)晶的方法。本文的研究有助于進一步解析RidL的晶體學研究和闡明其發(fā)揮功能的分子機制。
【關(guān)鍵詞】：嗜肺型軍團菌 逆向運輸復合物 RidL 晶體結(jié)構(gòu) X射線衍射
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-8
• Abstract8-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 軍團菌13-14
• 1.1.1 嗜肺型軍團菌(Legionella pneumophila)13-14
• 1.1.2 軍團菌病(Legionnaires’disease)14
• 1.2 嗜肺型軍團菌與分泌系統(tǒng)14-17
• 1.2.1 革蘭氏陰性菌的分泌系統(tǒng)14-16
• 1.2.2 Tcm/Dot Ⅳ型分泌系統(tǒng)16-17
• 1.3 嗜肺型軍團菌侵染過程17-19
• 1.3.1 進入宿主細胞17-18
• 1.3.2 LCV(Legionella-containing vacuoles)18-19
• 1.3.3 離開宿主細胞19
• 1.4 逆向運輸與Retromer復合物19-20
• 1.5 RidL在侵染中的作用20-21
• 1.6 本研究的意義21-23
• 第2章 實驗材料和實驗方法23-47
• 2.1 材料23
• 2.1.1 實驗材料23
• 2.2 實驗用酶、試劑、試劑盒23-24
• 2.2.1 分子克隆23
• 2.2.2 蛋白表達與純化23-24
• 2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)晶24
• 2.3 主要實驗儀器24-25
• 2.4 試劑配制25-29
• 2.4.1 常用試劑部分25-26
• 2.4.2 SDS-PAGE所需藥品26
• 2.4.3 SDS-PAGE蛋白電泳膠26-27
• 2.4.4 硒代蛋白表達部分27-28
• 2.4.5 親和純化及柱層析所用的緩沖液28-29
• 2.5 實驗方法29-47
• 2.5.1 RidL基因克隆29-33
• 2.5.2 目的基因的鑒定33-35
• 2.5.3 RidL蛋白的表達35-38
• 2.5.4 RidL蛋白純化38-41
• 2.5.5 蛋白結(jié)晶41-43
• 2.5.6 晶體的優(yōu)化43-45
• 2.5.7 衍射數(shù)據(jù)收集45-47
• 第3章 實驗結(jié)果與討論47-63
• 3.1 RidL的表達47
• 3.1.1 RidL的小量表達47
• 3.1.2 RidL的大量表達47
• 3.2 RidL的純化47-52
• 3.2.1 蛋白大量表達47-48
• 3.2.2 親和純化48-49
• 3.2.3 離子交換純化49-50
• 3.2.4 分子篩純化50-51
• 3.2.5 RidL硒代蛋白的表達和純化51-52
• 3.3 RidL結(jié)晶和晶體的優(yōu)化52-58
• 3.3.1 初步篩選52-54
• 3.3.2 晶體優(yōu)化54-58
• 3.4 RidL晶體衍射和數(shù)據(jù)處理58-63
• 3.4.1 配制合適的防凍液58
• 3.4.2 確定相位58-59
• 3.4.3 衍射數(shù)據(jù)的收集和處理59-61
• 3.4.4 提高RidL重原子衍生物分辨率的方法探討61-63
• 第4章 小結(jié)與展望63-65
• 參考文獻65-71
• 作者簡介和科研成果71

【共引文獻】

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