目的:利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和電穿孔技術(shù),在小鼠胰島素瘤胰島β細胞（Beta-TC-6）中剔除溶酶體膜蛋白Sidt2基因。方法:針對小鼠Sidt2基因設(shè)計向?qū)NA（sgRNA）,sgRNA退火合成雙鏈后克隆到px459載體中。測序鑒定成功的重組質(zhì)粒命名為px459-Sidt2并大量擴增。使用NEPA 21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將px459-Sidt2重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到Beta-TC-6細胞中,電轉(zhuǎn)染48 h后使用嘌呤霉素加壓進行陽性細胞篩選。陽性細胞擴增凍存,得到Sidt2基因剔除混合克隆細胞株,提取細胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法檢測細胞株中Sidt2的敲除效果。結(jié)果:成功構(gòu)建靶向小鼠Sidt2基因的px459重組質(zhì)粒px45-Sidt2。使用NEPA 21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)電轉(zhuǎn)Beta-TC-6的最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)為脈沖電壓150 V,脈沖時間5 ms,脈沖間隔50 ms,脈沖次數(shù)2次,電壓衰減10%,電穿孔模式為正方向。與對照組細胞相比,嘌呤霉素加壓篩選得到的Beta-TC-6陽性細胞中的Sidt蛋白表達缺失（P<0.05）,成功在小鼠胰島素瘤胰... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學院學報. 2019,38(03)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

設(shè)置脈沖電壓梯度加壓篩選72h后的陽性細胞

*T7E1酶切開的條帶;＊＊P＜0．05。圖3T7E1酶及westernblot檢測小鼠Sidt2基因的敲除效果3討論CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)成為繼鋅指蛋白(ZFPs)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEs)之后的第三代基因編輯技術(shù)［8－9］。與傳統(tǒng)的基因編輯工具相比具有諸多的優(yōu)點，首先CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)適應性和操作性強，來自產(chǎn)膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌的Cas9由于PAM識別序列僅為2個堿基(GG)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點［8］。Cas9蛋白在目前測試過的幾乎所有生物和細胞中均有活性，包括細菌、酵母、植物、魚以及哺乳動物細胞［10－14］;其次，CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)簡單易學，目前已有多種成熟的CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)質(zhì)粒載體，常規(guī)的分子生物學實驗室即可開展構(gòu)建，只需要將長約25bp左右的sgＲNA雙鏈連接到線性化的載體中，構(gòu)建難度相對于常見的表達載體和報告基因載體小，構(gòu)建完成的載體只需要通過菌落PCＲ或者測序即可鑒定，不必像構(gòu)建表達載體那樣擔心長片段的堿基突變問題。但是CＲISPＲ/Cas9質(zhì)粒需要表達的cas9蛋白相對于其他的載體偏大，一般常常在10kbp以上，轉(zhuǎn)染細胞難度較大，尤其對于難轉(zhuǎn)染細胞更是雪上加霜。雖然可以通過對成功轉(zhuǎn)染的細胞表達的抗生素篩選或者熒光標記束進行篩選，但是轉(zhuǎn)染效率低將對后續(xù)的篩選和單克隆培養(yǎng)造成很大的困難，并且cas9蛋白具有一定的細胞毒性［15］，后續(xù)的抗生素篩選和流式分選也會對轉(zhuǎn)染成功的細胞產(chǎn)生影響。因此提高CＲISPＲ/Cas9質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率是急需解決的問題。目前質(zhì)粒轉(zhuǎn)染主流的方法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、陽


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