目的:利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和電穿孔技術,在小鼠胰島素瘤胰島β細胞（Beta-TC-6）中剔除溶酶體膜蛋白Sidt2基因。方法:針對小鼠Sidt2基因設計向導RNA（sgRNA）,sgRNA退火合成雙鏈后克隆到px459載體中。測序鑒定成功的重組質粒命名為px459-Sidt2并大量擴增。使用NEPA 21高效基因轉染系統(tǒng)將px459-Sidt2重組質粒電轉到Beta-TC-6細胞中,電轉染48 h后使用嘌呤霉素加壓進行陽性細胞篩選。陽性細胞擴增凍存,得到Sidt2基因剔除混合克隆細胞株,提取細胞DNA及蛋白,利用T7酶以及Western blot方法檢測細胞株中Sidt2的敲除效果。結果:成功構建靶向小鼠Sidt2基因的px459重組質粒px45-Sidt2。使用NEPA 21高效基因轉染系統(tǒng)電轉Beta-TC-6的最佳電轉參數為脈沖電壓150 V,脈沖時間5 ms,脈沖間隔50 ms,脈沖次數2次,電壓衰減10%,電穿孔模式為正方向。與對照組細胞相比,嘌呤霉素加壓篩選得到的Beta-TC-6陽性細胞中的Sidt蛋白表達缺失（P<0.05）,成功在小鼠胰島素瘤胰... 

【文章來源】：皖南醫(yī)學院學報. 2019,38(03)

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【部分圖文】：

設置脈沖電壓梯度加壓篩選72h后的陽性細胞

*T7E1酶切開的條帶;＊＊P＜0．05。圖3T7E1酶及westernblot檢測小鼠Sidt2基因的敲除效果3討論CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)成為繼鋅指蛋白(ZFPs)、轉錄激活子樣效應因子核酸酶(TALEs)之后的第三代基因編輯技術［8－9］。與傳統(tǒng)的基因編輯工具相比具有諸多的優(yōu)點，首先CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)適應性和操作性強，來自產膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌的Cas9由于PAM識別序列僅為2個堿基(GG)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點［8］。Cas9蛋白在目前測試過的幾乎所有生物和細胞中均有活性，包括細菌、酵母、植物、魚以及哺乳動物細胞［10－14］;其次，CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)簡單易學，目前已有多種成熟的CＲISPＲ/Cas9基因編輯系統(tǒng)質粒載體，常規(guī)的分子生物學實驗室即可開展構建，只需要將長約25bp左右的sgＲNA雙鏈連接到線性化的載體中，構建難度相對于常見的表達載體和報告基因載體小，構建完成的載體只需要通過菌落PCＲ或者測序即可鑒定，不必像構建表達載體那樣擔心長片段的堿基突變問題。但是CＲISPＲ/Cas9質粒需要表達的cas9蛋白相對于其他的載體偏大，一般常常在10kbp以上，轉染細胞難度較大，尤其對于難轉染細胞更是雪上加霜。雖然可以通過對成功轉染的細胞表達的抗生素篩選或者熒光標記束進行篩選，但是轉染效率低將對后續(xù)的篩選和單克隆培養(yǎng)造成很大的困難，并且cas9蛋白具有一定的細胞毒性［15］，后續(xù)的抗生素篩選和流式分選也會對轉染成功的細胞產生影響。因此提高CＲISPＲ/Cas9質粒的轉染效率是急需解決的問題。目前質粒轉染主流的方法包括脂質體轉染、陽


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