本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用COI基因?qū)ξ覈x四個(gè)地理株的鑒定及蟲體抗原的免疫組分分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：旋毛蟲病(Trichinellosis)是一種因食用生的或未煮熟肉類感染旋毛蟲而引起的重要人畜共患寄生蟲病。我國存在旋毛形線蟲(T. spiral is)和鄉(xiāng)土旋毛蟲(T. native),其中旋毛形線蟲是引起人體旋毛蟲病的主要病原體。因感染的旋毛蟲蟲種不同、攝入蟲體的量、感染程度及個(gè)體的免疫反應(yīng)不同,旋毛蟲病患者表現(xiàn)出不同的癥狀：如腹瀉、惡心、發(fā)熱、乏力,眶周浮腫、彌漫性肌痛、癱瘓樣癥狀,甚至腦炎、心肌炎,其中心肌炎是導(dǎo)致病人死亡最主要的原因。因旋毛蟲病臨床癥狀的非特異性,其確診常通過實(shí)驗(yàn)室輔助檢查�；罱M織檢查作為旋毛蟲病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)被國際旋毛蟲病委員會(huì)推薦使用,但這種方法是損傷性檢查,病人依從性低。該方法在畜牧業(yè)和屠宰業(yè)中使用較廣,常因?yàn)楦腥驹缙诩訇幮月矢�、受取材部位、感染程度影響所致假陰性等�?dǎo)致漏診。目前用于檢測(cè)抗旋毛蟲抗體的血清學(xué)方法以ELISA的敏感性最高,具有經(jīng)濟(jì)、檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)化、特異性和敏感性比較穩(wěn)定以及檢測(cè)結(jié)果可信度高等優(yōu)點(diǎn),已被國際旋毛蟲病委員會(huì)列為推薦應(yīng)用的方法。旋毛蟲病有效抗原成分的研究是免疫診斷研究的基礎(chǔ),本研究以旋毛蟲云南地理株、湖北地理株、河南地理株和東北地理株為材料,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)和免疫印跡分析(Western blot, WB)對(duì)各地理株的蟲體抗原和排泄-分泌抗原進(jìn)行研究,以期了解不同地理株抗原組分及免疫效果的差異。本研究以4個(gè)旋毛蟲地理株為研究材料,以旋毛蟲感染昆明小鼠(約500條／只)建立動(dòng)物模型,感染后45 d解剖小鼠,通過人工消化法獲得旋毛蟲肌幼蟲。對(duì)獲得的蟲體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并用線粒體細(xì)胞色素氧化酶工基因(cytochrome c oxidase subunit I gene,COI)進(jìn)行蟲種鑒定。體外培養(yǎng)收集排泄-分泌抗原(excretory-secretory antigens, ESA),以凍融勻漿法制備蟲體抗原(crude muscle larvae antigens, CLA)。通過ELISA試驗(yàn)觀察不同地區(qū)來源旋毛蟲肌幼蟲抗原的敏感性、特異性及其與其他寄生蟲感染血清的交叉反應(yīng)。以聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和免疫印跡法分析蟲體抗原和排泄-分泌抗原的組分及有效免疫反應(yīng)組分。結(jié)果,各地理株獲得蟲體均達(dá)40 000條,包囊在顯微鏡下呈梭形,蟲體卷曲狀,洗滌后蟲體呈“C”形或卷曲運(yùn)動(dòng),表皮光滑,兩端鈍圓,無突起和附器,桿狀體約占蟲體前2/3。4個(gè)旋毛蟲地理株COI基因擴(kuò)增產(chǎn)物均在約400bp處出現(xiàn)明顯條帶,序列測(cè)定并拼接后,云南株380bp、湖北株380bp、河南株380bp、東北株380bp,經(jīng)BLAST與旋毛蟲ISS413株AF129486.1基因比對(duì),同源性均為99%,在第269位存在一個(gè)T-C轉(zhuǎn)位位點(diǎn)；4個(gè)蟲株該部分序列相似性為100%,均與旋毛形線蟲親緣關(guān)系較近,可能是同一蟲種。以制備的4個(gè)地理株蟲體抗原和排泄-分泌抗原進(jìn)行ELISA試驗(yàn),檢測(cè)旋毛蟲病患者血清敏感性100%,特異性100%。與血吸蟲病、棘球蚴蟲病、囊尾蚴病患者血清存在交叉反應(yīng),與華支睪吸蟲病、裂頭蚴病、鉤蟲病患者血清未見交叉反應(yīng)。蟲體抗原與血吸蟲病人血清反應(yīng)中,湖北地理株陽性率2.85%,東北地理株陽性率11.4%；蟲體抗原與棘球蚴病人血清反應(yīng)中,云南地理株陽性率11.7%,河南地理株陽性率5.8%；蟲體抗原與囊尾蚴病人血清反應(yīng)中,云南地理株陽性率為12%,湖北地理株陽性率16%,河南地理株陽性率32%,東北地理株陽性率12%。排泄-分泌抗原與血吸蟲病人血清反應(yīng)中,云南地理株陽性率2.85%,東北地理株陽性率11%；與囊尾蚴病人血清反應(yīng)中,云南地理株陽性率為12%,湖北地理株陽性率8%,河南地理株陽性率24%,東北地理株陽性率12%。SDS-PAGE分析4個(gè)旋毛蟲地理株蟲體可溶性抗原抗原條帶分子量范圍為100000-10000,均含有8條主帶,Mr為100000、66000、49000、45000、43000、30000、18000、12000；3條次帶,Mr為82000、80000、53000。排泄-分泌抗原Mr范圍為70000～10000,有8條主帶,Mr為66000、53000、49000、43000、40000、34000、30000、16000。Western blot分析結(jié)果顯示,旋毛蟲肌幼蟲蟲體可溶性抗原可與旋毛蟲病患者和感染小鼠血清的反應(yīng),條帶以Mr95000、72000、53000、49000、43000為主,排泄-分泌抗原反應(yīng)條帶以Mr 53000、49000、43000、40000為主。云南地理株蟲體抗原與血吸蟲病患者、裂頭蚴病患者、鞭蟲病患者、囊尾蚴病患者、鉤蟲病患者血清在Mr約95000處有可疑陽性反應(yīng)條帶。東北地理株排泄-分泌抗原與衛(wèi)氏并殖吸蟲病患者、囊尾蚴病患者血清在Mr約45 000處可見可疑反應(yīng)條帶。綜上所述,4個(gè)旋毛蟲地理株經(jīng)COI基因檢測(cè),鑒定為同一蟲種。制備各地理株蟲體可溶性抗原和排泄-分泌抗原,建立的ELISA方法對(duì)于旋毛蟲病的診斷具有較好的效果,SDS-PAGE 和 Western blot分析發(fā)現(xiàn)肌幼蟲蟲體可溶性抗原的95 000、72 000成分和排泄-分泌抗原的40 000成分可作為進(jìn)一步研究的重點(diǎn),為后續(xù)研究提供參考。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲 肌幼蟲 COI ELISA Western blot
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中英文全稱及縮寫對(duì)照4-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-17
• 技術(shù)路線17-18
• 第一部分 應(yīng)用COI基因鑒定四個(gè)旋毛蟲地理株蟲種18-28
• 引言18
• 1. 材料與方法18-21
• 2. 結(jié)果21-26
• 3. 討論26-28
• 第二部分 四個(gè)旋毛蟲地理株肌幼蟲蟲體蛋白和排泌蛋白的免疫診斷學(xué)效果觀察28-39
• 引言28
• 1. 材料與方法28-31
• 2. 結(jié)果31-37
• 2.1 獲得4個(gè)旋毛蟲地理株不同抗原濃度31-34
• 2.2 不同抗原做ELISA免疫檢測(cè)的效果34-37
• 3. 討論37-39
• 第三部分 四個(gè)旋毛蟲地理株肌幼蟲蟲體抗原的蛋白組分和免疫抗原組分分析39-47
• 引言39
• 1. 材料與方法39-42
• 2. 結(jié)果42-45
• 3. 討論45-47
• 第四部分 四個(gè)旋毛蟲地理株肌幼蟲排泄-分泌抗原的蛋白組分和免疫組分分析47-54
• 引言47
• 1. 材料與方法47-50
• 2. 結(jié)果50-53
• 3. 討論53-54
• 全文小結(jié)54-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 附圖59-61
• 致謝61-63
• 附錄163-64
• 附件64-69
• 綜述69-72

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