研究背景：副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，Vp）是一種嗜鹽性弧菌，可引起食物中毒、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和心臟疾病，副溶血弧菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒占的比例很高，發(fā)病呈世界性分布，并呈上升趨勢(shì)，我國(guó)沿海地區(qū)每年都有因副溶血弧菌引起食物中毒的報(bào)道。目前研究認(rèn)為副溶血弧菌的主要致病因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素，不耐熱溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）是其產(chǎn)生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌無(wú)論是臨床分離株，還是環(huán)境分離株都含有tlh基因，且具有種屬特異性，國(guó)外研究利用tlh基因?qū)Ω比苎【M(jìn)行監(jiān)測(cè)和檢測(cè)，但對(duì)其功能和致病性研究的相對(duì)較少，國(guó)內(nèi)未見相關(guān)研究報(bào)道，目前對(duì)TLH的功能和致病性仍不清楚。 研究目的；本研究旨在利用編碼TLH毒素的tlh基因在副溶血弧菌存在的廣泛性和種屬特異性，克隆tlh基因，構(gòu)建原核融合表達(dá)載體，純化獲得具有生物活性功能的TLH，對(duì)其功能、致病性和免疫原性等方面進(jìn)行研究。 研究方法： 1．以副溶血弧菌國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株Vp14-90基因組DNA為模板，擴(kuò)增tlh基因，構(gòu)建克隆載體pGEM-tlh，酶切及P... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：92 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 副溶血弧菌不耐熱溶血毒素tlh基因的體外擴(kuò)增、克隆及序列分析
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 引物的設(shè)計(jì)與合成
            (二) VP14-90基因組DNA的提取
            (三) tlh基因高保真擴(kuò)增
            (四) PCR產(chǎn)物加A反應(yīng)
            (五) 目的基因tlh的純化回收
            (六) tlh基因克隆
            (七) 重組克隆的篩選與鑒定
            (八) tlh基因的序列測(cè)定及同源性分析
            (九) tlh14-90基因的生物信息學(xué)分析
    結(jié)果
        一、 tlh14-90基因的擴(kuò)增
        二、 pGEM-tlh重組質(zhì)粒的篩選和鑒定
        三、 tlh14-90基因測(cè)序結(jié)果
        四、 tlh14-90基因的生物信息學(xué)分析
    討論
    小結(jié)
第二部分 副溶血弧菌不耐熱溶血毒素重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 目的基因tlh14-90片斷的獲得
            (二) pET32a+質(zhì)粒DNA的提取、限制性內(nèi)切酶消化及純化回收
            (三) 表達(dá)載體的構(gòu)建
            (四) 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定
            (五) 免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
    結(jié)果
        一、 重組表達(dá)載體pET32a-tlh的酶切及PCR鑒定
        二、 陽(yáng)性重組克隆(pET32a-tlh/DE3)的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定
        三、 免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)結(jié)果
    討論
    小結(jié)
第三部分 重組蛋白的表達(dá)與純化
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 表達(dá)產(chǎn)物可溶性的確定
            (二) tlh14-90基因在大腸桿菌中的表達(dá)及SDS-PAGE分析
            (三) 表達(dá)產(chǎn)物的純化
    結(jié)果
        一、 tlh14-90基因在大腸桿菌中的表達(dá)及可溶性
        二、 表達(dá)條件的優(yōu)化
        三、 表達(dá)蛋白的純化
    討論
    小結(jié)
第四部分 副溶血弧菌不耐熱毒素的復(fù)性、免疫原性及功能的研究
    材料與方法
        一、 材料
        二、 實(shí)驗(yàn)方法
            (一) 純化蛋白的復(fù)性
            (二) 功能研究
            (三) 免疫原性的研究
    結(jié)果
        一、 復(fù)性結(jié)果
        二、 復(fù)性蛋白TLH14-90的功能研究
            (一) 溶血功能
            (二) 兔腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)
            (三) 兔腸病理改變結(jié)果
            (四) 耐熱實(shí)驗(yàn)
            (五) 免疫原性的研究
            (六) 保護(hù)性抗原作用
            (七) 溶血抑制實(shí)驗(yàn)
    討論
    小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
綜述
附錄1: tlh14-90 GeneBank收錄結(jié)果
附錄2: TLH14-90 GeneBank收錄結(jié)果
附錄3: 碩士期間論文發(fā)表情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]人重組載脂蛋白E在大腸桿菌中的表達(dá)和純化[J]. 國(guó)漢邦,董軍,王抒.  中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志. 2002(05)
[2]應(yīng)用地高辛標(biāo)記的寡聚核酸探針檢測(cè)副溶血弧菌[J]. 蔣魯巖,陳光哲,祝長(zhǎng)青,秦敏,張常印.  檢驗(yàn)檢疫科學(xué). 2002(04)
[3]副溶血弧菌的致病性及其檢驗(yàn)和測(cè)定[J]. 喬華林,章俊.  水產(chǎn)科學(xué). 1999(04)
[4]合成特異性寡核苷酸探針檢測(cè)KP陽(yáng)性副溶血弧菌[J]. 王保龍,黃尊波.  中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志. 1994(05)
[5]大腸桿菌腸毒素的研究[J]. 林成水,曾凝梅,葉榮華,鄭金鳳,郭維植.  微生物學(xué)通報(bào). 1984(02)



本文編號(hào)：3279361