心肌壞死導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)一步導(dǎo)致心衰、心肌重構(gòu)等。由于成年化的心肌細(xì)胞不能分裂，尋找可替代死亡心肌細(xì)胞的移植物來(lái)治療心肌壞死是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞具有多分化潛能，適宜條件下可分化為多種細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體的不同器官與組織。利用 ES 細(xì)胞的分化潛能和定向分化的可調(diào)性，將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，可以作為心肌細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來(lái)源。但是，對(duì)這種來(lái)源的心肌細(xì)胞要求很高純度，因?yàn)槿芨杉?xì)胞移植到個(gè)體可能會(huì)導(dǎo)致畸胎瘤。研究表明，通過(guò)基因操作可以從分化的 ES 細(xì)胞中純化獲得所需的心肌細(xì)胞。 α-actin 是心臟發(fā)生的最早標(biāo)志，在 ES 細(xì)胞分化為自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞之前特異性表達(dá)，指導(dǎo)其組織特異性表達(dá)的是α-actin 基因啟動(dòng)子。對(duì)這一啟動(dòng)子的研究，不僅可間接研究心肌發(fā)育過(guò)程，更重要的是可以用來(lái)做調(diào)控序列純化 ES 細(xì)胞源心肌細(xì)胞作移植治療。本實(shí)驗(yàn)的目的旨在構(gòu)建出含人類心肌α-actin 啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體，用來(lái)轉(zhuǎn)染小鼠 ES 細(xì)胞，純化和進(jìn)一步研究 ES 細(xì)胞源心肌細(xì)胞。我們用 PCR 法直接從全基因組中擴(kuò)增人類心肌α-actin 基因的啟動(dòng)子片段，連接到 pMD-18T... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
文獻(xiàn)綜述 胚胎干細(xì)胞分化的研究進(jìn)展及其與心肌損傷性疾病的治療
    1 胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特征
        1.1 ES 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
        1.2 ES 細(xì)胞的高度分化潛能
        1.3 ES 細(xì)胞的分子標(biāo)記
        1.4 ES 細(xì)胞顯著區(qū)別于其他細(xì)胞系的幾大特征
    2 胚胎干細(xì)胞定向分化的研究進(jìn)展
        2.1 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的一般方法
            2.1.1 細(xì)胞因子誘導(dǎo)法
            2.1.2 選擇性標(biāo)記基因篩選目的細(xì)胞法
            2.1.3 特異性轉(zhuǎn)錄因子異位表達(dá)法
            2.1.4 藥物及化學(xué)試劑誘導(dǎo)法
        2.2 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究概況
            2.2.1 心肌細(xì)胞
            2.2.2 神經(jīng)細(xì)胞
            2.2.3 造血細(xì)胞
            2.2.4 血管和內(nèi)皮細(xì)胞
            2.2.5 胰島素分泌細(xì)胞
            2.2.6 脂肪細(xì)胞
            2.2.7 向其他細(xì)胞和組織定向分化
    3 胚胎干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化研究存在的問(wèn)題
        3.1 誘導(dǎo) ES 細(xì)胞向某一特定類型細(xì)胞分化的技術(shù)尚不成熟
        3.2 建立無(wú)血清培養(yǎng)誘導(dǎo)體系
        3.3 特定分化細(xì)胞的擴(kuò)增
        3.4 分化細(xì)胞應(yīng)用于移植治療的免疫排斥問(wèn)題
        3.5 分化細(xì)胞應(yīng)用于移植治療的安全性問(wèn)題
    4 胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究展望
    5 胚胎干細(xì)胞與心肌損傷性疾病的治療
實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一 人類心肌 Α-ACTIN 啟動(dòng)子基因的克隆
        1 材料
            1.1 主要儀器設(shè)備
            1.2 酶及主要試劑
            1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株
        2 方法
            2.1 人流產(chǎn)胎兒心肌總 DNA 的提取
            2.2 人類心肌 Α-ACTIN 啟動(dòng)子基因的 PCR 擴(kuò)增
                2.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
                2.2.2 人類心肌 α-actin 啟動(dòng)子基因的 PCR 擴(kuò)增
            2.3 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、回收
                2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳
                2.3.2 PCR 電泳產(chǎn)物的回收
            2.4 人類心肌 Α-ACTIN 啟動(dòng)子基因的克隆
                2.4.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
                2.4.2 pMD18-T-α-actin-P 的構(gòu)建
            2.5 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的篩選及鑒定
                2.5.1 堿裂解法提取質(zhì)粒 DNA
                2.5.2 酶切鑒定
            2.6 測(cè)序
        3 結(jié)果
            3.1 目的基因的擴(kuò)增:
            3.2 回收后電泳結(jié)果
            3.3 目的基因的 TA 克隆和篩選
            3.4 測(cè)序結(jié)果
        4 討論
    實(shí)驗(yàn)二 含人類心肌 Α-ACTIN 啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其應(yīng)用
        1 材料
            1.1 質(zhì)粒
            1.2 試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液
            1.5 小鼠胚胎干細(xì)胞
        2 方法
            2.1 人類 Α-ACTIN 啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.1.1 pEGFP-N1 中巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的去除
                2.1.2 人類 α-actin 啟動(dòng)子真核表達(dá)載體 pEGFP-N1-α-actin-P 的構(gòu)建
            2.2 含有人類 Α-ACTIN 啟動(dòng)子的 PEGFP-N1-Α-ACTIN-P 質(zhì)粒純化
            2.3 小鼠胚胎干細(xì)胞的制備
                2.3.1 小鼠成纖維細(xì)胞的分離與純化
                2.3.2 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備
                2.3.3 小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和增殖
            2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與增殖
                2.4.1 轉(zhuǎn)染
                2.4.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選與增殖
                2.4.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的免疫組化檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 人類 Α-ACTIN 啟動(dòng)子真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.2 小鼠 ES 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選
            3.3 免疫組化結(jié)果
        4 討論
            4.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            4.2 小鼠 ES 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選
            4.3 PEGFP-N1-Α-ACTIN-P 重組質(zhì)粒在小鼠 ES 細(xì)胞中的表達(dá)
        5 實(shí)驗(yàn)中存在的問(wèn)題
結(jié) 論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3267527