目的:從全人源單鏈抗體文庫中篩選并鑒定抗金黃色葡萄球菌α-溶血素（α-HL）單鏈抗體。方法:IPTG低溫誘導(dǎo)α-HL融合蛋白表達(dá)并純化鑒定;采用噬菌體展示技術(shù)從單鏈抗體文庫中篩選抗α-HL全人源單鏈抗體（sc Fv）。將篩選并測序鑒定正確的15株sc Fvs插入p LZ16載體進(jìn)行表達(dá)驗證和ELISA鑒定。結(jié)果:表達(dá)純化的α-HL融合蛋白為可溶性蛋白,大小約為90 k D。采用表達(dá)的α-HL融合蛋白作為抗原,經(jīng)過4輪噬菌體展示篩選,ELISA結(jié)果顯示大約有34%的sc Fvs與α-HL具有結(jié)合特性。將與α-HL結(jié)合良好且序列正確的15株sc Fvs插入p LZ16載體中進(jìn)行可溶性表達(dá)后,經(jīng)Western blot驗證正確; ELISA鑒定結(jié)果顯示:sc Fvs與購買的α-HL（Sigma,USA）、金黃色葡萄球菌都具有較高的結(jié)合活性且對金黃色葡萄球菌特異,與白色葡萄球菌無交叉反應(yīng)。結(jié)論:成功篩選到抗α-HL全人源單鏈抗體。 

【文章來源】：中國免疫學(xué)雜志. 2019,35(09)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

SDS-PAGE電泳分析純化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinby

1α-HL融合蛋白的純化及鑒定P-ColdTF融合表達(dá)載體攜帶有氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因，所以用Amp作為抗性篩選目的蛋白，并且P-ColdTF融合表達(dá)載體攜帶有多聚組氨酸標(biāo)簽(His-Tag)，因此利用Ni-NTA親和純化系統(tǒng)中nickel-IMACresin對His-Tag的結(jié)合特性進(jìn)行純化。蛋白表達(dá)并純化完成后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示:成功純化出單一的目的蛋白，其大小為90kD(圖1)，其中載體上的TF分子伴侶大小為48kD，主要用于增加蛋白表達(dá)的可溶性。采用免疫蛋白印跡法Westernblot鑒定蛋白，證明表達(dá)純化的蛋白即為目的蛋白α-HL(圖2)。2.2抗α-HL全人源單鏈抗體的篩選將純化的α-HL融合蛋白生物素化，并將其作為抗原，采用免疫磁珠法對天然全人源單鏈抗體文庫進(jìn)行4輪噬菌體展示富集，從富集4輪后的單鏈抗體文庫中隨機挑取克隆子，采用phage-ELISA法進(jìn)行抗原抗體結(jié)合鑒定。結(jié)果顯示:經(jīng)4輪噬菌體展示篩選后，特異性單鏈抗體得到富集。隨機挑取的1000余個克隆子進(jìn)行ELISA初篩，取2個不包被抗原的酶標(biāo)孔作為陰性對照。結(jié)果顯示，陰性對照OD450值為0.05左右，部分克隆子與抗原有結(jié)合反應(yīng)，其中OD450＞0.8圖1SDS-PAGE電泳分析純化后的α-HL融合蛋白Fig．1Analysisofpurifiedα-HLfusionproteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的陽性單鏈抗體占34%左右，圖3為采用ELISA篩選出的部分克隆子。2.3單鏈抗體的測序鑒定將OD450值最高的18株單鏈抗體進(jìn)行大量表達(dá)后提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明:其中15株單鏈抗體測序序列為開放閱讀圖2免疫印跡法驗證α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-Stained

roteinbySDS-PAGENote:Marker.Proteinmolecularweightmarker;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.的陽性單鏈抗體占34%左右，圖3為采用ELISA篩選出的部分克隆子。2.3單鏈抗體的測序鑒定將OD450值最高的18株單鏈抗體進(jìn)行大量表達(dá)后提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果表明:其中15株單鏈抗體測序序列為開放閱讀圖2免疫印跡法驗證α-HL融合蛋白Fig．2Identificationofα-HLfusionproteinbyWesternblotNote:Marker.BenchMarkTMPre-StainedProteinLadder;Lanes1－3.Expressedproteinofα-HLfusionprotein.圖3ELISA初篩抗α-HL全人源單鏈抗體Fig．3PreliminaryselectionofscFvsagainstα-HLbyELISANote:1－82.Numberofdifferentclones.Theabsorbance(A)readingat450nmwastakenastheresult.ThenegativecontrolwasaboutOD450=0.05.圖4抗α-HL全人源單鏈抗體條狀結(jié)構(gòu)圖Fig．4Ｒibbondiagramofanti-α-HLpositivescFv(scFv777)Note:Variableregions(bothVHandVL)wereshowninyellow.·2011·中國免疫學(xué)雜志2019年第35卷


本文編號：3250158