發(fā)布時(shí)間：2021-06-25 20:05

　　目的:Pleiotrophin （Ptn,多效生長(zhǎng)因子）是一種分泌性生長(zhǎng)因子,具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移及腫瘤血管生成等功能。本研究旨在通過(guò)設(shè)計(jì)一種能夠有效抑制該基因表達(dá)的小干擾RNA,以遏制Pten^-/-細(xì)胞的惡性表型,從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展的目的。方法:（1）設(shè)計(jì)并合成具有基因特異性的一組寡核苷酸片段,克隆到pSilencerTM 3.1-H1 hygro載體;（2）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)載體至3T3細(xì)胞,以檢測(cè)不同siRNA對(duì)Ptn基因表達(dá)的抑制能力;（3）用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染和潮霉素篩選等方法建立能穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)Ptn siRNAs的一組Pten^-/- MEF241細(xì)胞株,并對(duì)其Ptn表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè);（4）利用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、Western blot檢測(cè)沉默Ptn基因?qū)ten^-/-MEF241細(xì)胞生長(zhǎng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響;（5）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察Ptn基因沉默后,Pten^-/-MEF241細(xì)胞致瘤的特性。結(jié)果:設(shè)計(jì)并合成了3條針對(duì)Ptn基因的siRNAs,并證實(shí)其中... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：61 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

PsilencerTM3.0-H1hygro表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖

圖 1-2：退火后的發(fā)夾狀的 siRNAFigure1-2:Annealed hairpin siRNA template insert（3）酶切：將 pSilenceTM3.1 hygro 載體進(jìn)行 BamHⅠ 和 Hind Ⅲ 雙酶切，酶切后將產(chǎn)物進(jìn)行乙醇沉淀純化回收。估計(jì) DNA 溶液的體積，加入 1/9 體積濃度為3M Ph5.2 的 NaAc，充分混勻。加入兩倍體積的冰冷乙醇，充分混勻；冰浴 15-30分鐘；以 13000rpm/min 以上轉(zhuǎn)速 0℃ 離心 10 分鐘，棄上清；沉淀 DNA 中加入1ml 70%乙醇，以 13000rpm/min 以上轉(zhuǎn)速 0℃ 離心 2 分鐘；小心吸出上清，并將上清保留，所剩固體為 DNA ；室溫?fù)]發(fā)，重溶測(cè)濃度。(4)連接： 將退火后的 siRNA A, siRNA B, siRNA C 雙鏈 DNA 與酶切純化后的pSilencerTM3.1 質(zhì)粒連接。取 5ul 退火產(chǎn)物加入 45 ul 無(wú)菌水，使其終濃度為8ng/ul 。管中加入下述各物:Plus-insert Minus-insert Component1ul _ 稀釋的退火后 siRNA insert

（7）放射自顯影：將洗干凈含有目的 RNA 的膜有 RNA 的面朝上。-70℃放射自顯影 48-72 小時(shí)洗去探針，（90-100 H2O/0.5%SDS）洗膜 10 分鐘保鮮膜包裹保存。2 結(jié)果與討論2.1 結(jié) 果2.1.1 根據(jù) Ambion 公司的 siRNA 設(shè)計(jì)原采用小干擾 RNA （siRNA）技術(shù)沉默 Pleiot小鼠 Pleiotrophin 基因的 siRNA 的寡核苷酸構(gòu)建載體。其編碼的 siRNA 見(jiàn)圖 1-3。


本文編號(hào)：3249867