目的 旨在探討質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾狀RNA（shRNA，short hairpin RNA）對(duì)人呼吸道粘膜下腺細(xì)胞（SPC-A1）水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）表達(dá)的抑制。方法 用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)AQP5和MUC5AC在SPC-A1細(xì)胞上的表達(dá)。構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)shAQP5重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SPC-A1細(xì)胞。用熒光定量PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，用FACS和Western雜交檢測(cè)蛋白表達(dá)。結(jié)果 AQP5和MUC5AC在SPC-A1上均有表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染組（Con）和無關(guān)轉(zhuǎn)染組（shNeg）比較，shAQP5組細(xì)胞AQP5 mRNA表達(dá)在轉(zhuǎn)染后1、2天明顯降低，3-7天mRNA水平有輕度回調(diào)，而蛋白的明顯抑制出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第5天。結(jié)論 質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA（shRNA）可有效抑制人呼吸道黏膜下腺細(xì)胞膜AQP5的表達(dá)，AQP5蛋白水平的抑制滯后于mRNA水平。若能將RNA干擾用于AQPs的其它亞型將拓展AQPs生理功能的研究。 目的 shRNA介導(dǎo)的AQP5的抑制是否影響SPC-A1細(xì)胞滲透壓驅(qū)動(dòng)的水跨膜通透性。方法 細(xì)胞分3組即Con組，shNeg組，shAQP5... 

【文章來源】：復(fù)旦大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

陽性克隆菌抽提質(zhì)粒后雙酶切鑒定電泳圖

篩選出陽性克隆(圖l)，ECoRI、BamHI雙酶切鑒定，若核昔酸序列己連接到載體上(圖2)海生工生物技術(shù)公司測(cè)序鑒定，結(jié)果shNeg均已成功地連接至IJrsilencer

負(fù)載濃度的Caleein一AM進(jìn)行研究，均未發(fā)現(xiàn)SPC一Al細(xì)胞存在該現(xiàn)象。我們的灌流結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞體積成反比，而與滲透壓成正比，即隨著滲透壓增高，細(xì)胞體積縮小，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，反之(圖6)。a。熒光變化趨勢(shì)圖 SeriesonGreen，AI!P!anes者的u巴lu門山口﹂田^哎251 lmagePlane圖6:滲透壓驅(qū)動(dòng)下細(xì)胞熒光強(qiáng)度及體積變化趨勢(shì)。按照300一200一300礴00一300(mosm)的順序?qū)x定的細(xì)胞區(qū)域(巧一20個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行微灌流。a.為熒光顯微鏡下細(xì)胞照片。b.為熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線圖。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大鼠肺氣腫組織表皮生長(zhǎng)因子受體及黏蛋白表達(dá)的關(guān)系研究[J]. 毛翎,白春學(xué),王悅虹,張敏.  中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志. 2005(01)
[2]表皮生長(zhǎng)因子受體和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病氣道中的表達(dá)及意義[J]. 毛翎,白春學(xué),張敏,王悅虹,陳杰.  中華結(jié)核和呼吸雜志. 2004(09)
[3]呼吸道表面液體層的生理功能與測(cè)定[J]. 宋元林,白春學(xué).  中華結(jié)核和呼吸雜志. 2003(10)
[4]水通道與鈉通道在小鼠胸腔液體轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用[J]. 蔣進(jìn)軍,白春學(xué),洪群英,宋元林.  中華結(jié)核和呼吸雜志. 2003(01)
[5]肺泡液體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)及肺水通道的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 白春學(xué),陳智偉,宋元林,方曉惠,鈕善福,Matthay MA,Verkman AS.  中華結(jié)核和呼吸雜志. 2001(02)



本文編號(hào)：3246231