本文關(guān)鍵詞：受體相互作用蛋白激酶3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:探討受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase 3,RIPK3)基因啟動(dòng)子功能序列與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用及其Cp G島甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)水平的關(guān)系。方法:(1)采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并分析啟動(dòng)子序列后,行啟動(dòng)子缺失突變轉(zhuǎn)化分析,即PCR方法對(duì)RIPK3基因不同長(zhǎng)度的序列片段進(jìn)行擴(kuò)增,以熒光素酶載體構(gòu)建質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T細(xì)胞),采用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)區(qū)域啟動(dòng)活性,鑒定功能啟動(dòng)子的可能區(qū)域。利用軟件預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),并通過突變轉(zhuǎn)化分析鑒定RIPK3基因核心轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。(2)在293T細(xì)胞中,通過檢測(cè)過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子刺激蛋白1(stimulating protein 1,Sp1)/刺激蛋白3(stimulating protein 3,Sp3)和Sp1/Sp3顯性負(fù)突變體后以及基因選擇性Sp1抑制劑光神霉素處理后啟動(dòng)子活性的檢測(cè)研究轉(zhuǎn)錄因子刺激蛋白家族與RIPK3啟動(dòng)子之間的關(guān)系。(3)采用凝膠電泳遷移分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3與RIPK3啟動(dòng)子之間的相互作用關(guān)系。(4)采用RNA干擾技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3在293T細(xì)胞中與RIPK3啟動(dòng)子的相互作用以及在人大腸癌細(xì)胞(HT-29細(xì)胞)中與RIPK3表達(dá)的作用情況。(5)采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)研究在表達(dá)與不表達(dá)RIPK3的細(xì)胞系中以及甲基化抑制劑處理后的不表達(dá)RIPK3的細(xì)胞系中甲基化在RIPK3基因啟動(dòng)子區(qū)域的修飾情況。結(jié)果:(1)化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)表明:RIPK3基因的5'非翻譯區(qū)(5'-non-translated region,5'UTR)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcriptional start site,TSS)上游19個(gè)堿基片段是RIPK3基因啟動(dòng)子的功能序列;缺失突變轉(zhuǎn)化分析提示該功能序列包含三個(gè)GC盒(GC box),其中第二個(gè)為RIPK3基因轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3的核心結(jié)合位點(diǎn)。(2)過表達(dá)研究結(jié)果表明,Sp1/Sp3對(duì)RIPK3基因啟動(dòng)子活性激活起主導(dǎo)作用。(3)凝膠電泳遷移分析的結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子Sp1/Sp3與GC富集區(qū)特異性相互作用。(4)Sp1小干擾RNA或Sp3小干擾RNA與RIPK3啟動(dòng)子功能區(qū)和熒光素酶載體構(gòu)建的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,比較得出RIPK3啟動(dòng)子活性明顯減低。(5)亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在表達(dá)RIPK3的HT-29細(xì)胞系中RIPK3基因啟動(dòng)子功能序列低度甲基化,在不表達(dá)RIPK3的結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116細(xì)胞)中RIPK3啟動(dòng)子功能序列呈現(xiàn)高度甲基化。5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-Cd R)處理后,HCT-116細(xì)胞里RIPK3啟動(dòng)子功能序列甲基化的頻率明顯下降,RIPK3表達(dá)相應(yīng)上調(diào)。結(jié)論:RIPK3基因的5'UTR及TSS上游19個(gè)堿基序列片段是RIPK3基因啟動(dòng)子的功能序列。RIPK3基因的啟動(dòng)活性受刺激蛋白1和刺激蛋白3劑量依賴調(diào)控。在不表達(dá)RIPK3的HCT-116里,RIPK3基因的功能啟動(dòng)序列呈現(xiàn)的甲基化頻率很高。該細(xì)胞系使用5-aza-Cd R處理后,RIPK3基因的功能啟動(dòng)序列呈現(xiàn)的甲基化頻率較前明顯下降,其蛋白表達(dá)相應(yīng)上調(diào)。以上結(jié)果提示,日后在治療RIPK3相關(guān)的臨床疾病過程中,我們可以嘗試通過靶向RIPK3基因,進(jìn)而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終達(dá)到一定的治療效果。
【關(guān)鍵詞】：受體相互作用蛋白激酶3 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) CpG島 5-氮-2'-脫氧胞苷
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-15
• 結(jié)果15-30
• 討論30-32
• 結(jié)論32-33
• 創(chuàng)新點(diǎn)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-38
• 附圖38-40
• 綜述40-50
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 中英文對(duì)照縮略詞表50-51
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文51-52
• 致謝52-53

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本文編號(hào)：322347