目的構(gòu)建人E1A激活基因阻遏子基因（hCREG）不同截短片段的啟動子增強型綠色熒光蛋白（pEGFP1）報告基因載體,比較各啟動子轉(zhuǎn)錄活性,從而確定hCREG核心啟動子區(qū)。方法通過查詢美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫hCREG序列并結(jié)合啟動子特點,獲得長度為2003（–1925/+78） bp的啟動子片段。利用PCR法及雙酶切法截短5個啟動子片段并克隆至pEGFP1中,構(gòu)建pEGFP1_hCREG₂003、pEGFP1_hCREG₉45、pEGFP1_hCREG₅86、pEGFP1_hCREG₄78、pEGFP1_hCREG₃58報告基因載體質(zhì)粒。并將其與內(nèi)參質(zhì)粒pGL4.73[hRluc/SV40]瞬時共轉(zhuǎn)染入293T細胞48 h,熒光顯微鏡下觀察pEGFP1_hCREG啟動子報告基因的綠色熒光表達;采用實時定量PCR檢測各啟動子mRNA的表達,并確... 

【文章來源】：解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2019,44(07)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

圖2雙酶切或PCR法獲得4個hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordouble

MedJChinPLA,Vol.44,No.7,July28,2019589圖3瓊脂糖凝膠電泳雙酶切鑒定Fig.3DNAplasmididentifiedbyrestrictionendonucleasesdigestionA.pEGFP1_hCREG_2003；B.pEGFP1_hCREG_945；C.pEGFP1_hCREG_586；D.pEGFP1_hCREG_478；E.pEGFP1_hCREG_358圖2雙酶切或PCR法獲得4個hCREG基因上游DNA片段Fig.2FourDNAfragmentsofhCREGbyPCRordoubleenzymedigestionM.DL-2000-DNA-Marker；1-4.目的DNA片段長度分別為945、586、478bp和358bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp945bp586bp478bp358bpM123410000bp7000bp4000bp2000bp1000bp500bp250bpABCDE圖4質(zhì)粒pEGFP1_hCREG_586部分基因測序結(jié)果Fig.4PartofDNAplasmidpEGFP1_hCREG_586identifiedbysequencing

告基因mRNA表達水平Fig.6mRNAexpressionlevelsoffivepEGFP1_hCREGpromoterreportergenes(Quantitativereal-timePCR)與pEGFP1_hCREG_2003比較，(1)P<0.05；與pEGFP1_hCREG_945比較，(2)P<0.05；與pEGFP1_hCREG_586比較，(3)P<0.05；與pEGFP1_hCREG_478比較，(4)P<0.05(n=6，F(xiàn)=62.440)。2.01.51.00.50hCERGmRNA(/GAPDH)pEGFP1_hCREG_2003pEGFP1_hCREG_945pEGFP1_hCREG_586pEGFP1_hCREG_478pEGFP1_hCREG_358(1)(2)(3)(1)(2)(3)(4)圖7生物信息學(xué)預(yù)測hCREG基因–508/–281片段可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子Fig.7BioinformaticspredictedpotentialtranscriptionfactorsboundinthehCREGgene–508/–281bpfragment區(qū)域(翻譯起始位點ATG為下游+79)不同截短片段的pEGFP1報告基因載體，行缺失驗證，以求獲得hCREG基因核心啟動子序列。本研究采用的GFP基因的優(yōu)點在于不需要抗體、輔助因子或酶底物等其他介質(zhì)，攜帶GFP的融合蛋白在熒光顯微鏡下，用紫外線激發(fā)后即可觀察到綠色熒光，直觀、簡便，而且靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率。另外GFP無種屬特異性，在原核和真核生物中均可表達[9]；蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定，具有在真核細胞中穩(wěn)定表達的抗生素篩選基因，且因其分子量小，無細胞毒性。但也存在對于不同的蛋白濃度、離子強度、溫度和pH

【參考文獻】：
期刊論文
[1]ING5基因?qū)θ橄侔┘毎鸅cap-37惡性表型的影響[J]. 宋洋,萬義增,趙樹鵬,齊鳳杰,方磊,伍繼成,時帥,鄭華川.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2017(01)
[2]慢病毒載體介導(dǎo)增強型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染大鼠角膜的效率及其毒性研究[J]. 劉立,趙敏.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2014(04)
[3]轉(zhuǎn)錄因子E2F1抑制CREG表達調(diào)控體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞分化[J]. 韓雅玲,趙昕,閆承慧,康建,張效林,鄧捷,徐紅梅,劉海偉.  生物化學(xué)與生物物理進展. 2007(05)



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