用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人體外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生hG-CSFmRNA和hG-CSF，誘導(dǎo)第4小時(shí)合成hG-CSFmRNA，第12小時(shí)培養(yǎng)介質(zhì)中檢測(cè)出hG-CSF，第24小時(shí)達(dá)高峰。用酸性鈑-酚-氯仿法提取LPS誘導(dǎo)4小時(shí)的人單核細(xì)胞總RNA，然后用兩個(gè)特異性引物通過(guò)RNA PCR技術(shù)擴(kuò)增得到所需的G-CSFcDNA。在PCR反應(yīng)中，使用了不同的退火溫度，以選擇PCR的最適條件，結(jié)果是當(dāng)退火溫度67℃時(shí)，擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物最多，非特異性產(chǎn)物最少。將擴(kuò)增的G-CSFcDNA分別插入到質(zhì)粒pUC18和分泌型表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化受體菌。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選，并用斑點(diǎn)雜交和Southern blot方法作了鑒定，最后得到了4個(gè)全長(zhǎng)cDNA的陽(yáng)性克隆。插入hG-CSFcDNA的分泌型表達(dá)鼠體在大腸桿菌內(nèi)經(jīng)IPTO的誘導(dǎo)，表達(dá)出rhG-CSF，并分泌到細(xì)菌的周質(zhì)部位。用雙單抗夾心ELISA法檢測(cè)IPTO誘導(dǎo)的重組體細(xì)菌的周質(zhì)蛋白，其酶標(biāo)反應(yīng)讀效顯著高于未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組體細(xì)菌和載體對(duì)照細(xì)菌。這證明我們已經(jīng)克隆到了hG-CSFcDNA，并且成功地進(jìn)行了表達(dá)。 

【文章來(lái)源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：52 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
一、題目：人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)cDNA的克隆和表達(dá)
二、摘要
三、前言
四、材料和方法
    (一) 材料
        1.實(shí)驗(yàn)試劑
        2.器材
    (二) 實(shí)驗(yàn)方法
        1.正常人外周血單核細(xì)胞的分離
        2.脂多糖(LPS)誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞
        3.酸性鈲鹽—酚—氯仿法提取LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞總RNA
        4.用特異性3’端引物逆轉(zhuǎn)錄合成G-CSFcDNA的第一條鏈
        5.用PCR技術(shù)擴(kuò)增G-CSF mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
        6.分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒的提取
        7.分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒和質(zhì)粒pUC_(1(?))的酶切和去磷酸
        8.PCR產(chǎn)物(G-CSF cDNA)的磷酸化和純化
        9.G-CSF cDNA的克隆及鑒定
        10.G-CSF cDNA的重組體在受體菌中的表達(dá)
        11.雙單克隆抗體夾心ELISH法檢測(cè)rhG-CSF
五、結(jié)果
    (一) 脂多糖誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF
    (二) 酸性鈲鹽—酚—氯仿法提取LPS誘導(dǎo)的單核細(xì)胞總RNA
    (三) RNA PCR技術(shù)擴(kuò)增G-CSF cDNA
    (四) 分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒的提取和酶切產(chǎn)物的鑒定
    (五) hG-CSF cDNA的克隆和鑒定
    (六) hG-CSF cDNA重組質(zhì)粒在受體菌中的表達(dá)
六、討論
    (一) LPS誘導(dǎo)人單核細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF mRNA和G-CSF
    (二) 用RNA PCR技術(shù)擴(kuò)增G-CSF cDNA
    (三) G-CSF cDNA的克隆和表達(dá)
    (四) 夾心ELISA法檢測(cè)G-CSF
    (五) rhG-CSF的應(yīng)用前景及進(jìn)一步研究設(shè)想
七、參考文獻(xiàn)
八、致謝
綜述
Reference


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]在大腸桿菌中分泌型表達(dá)人α心鈉素衍生物[J]. 李磊,郭文彤,李光地,王健平,張迺蘅,李載平,曾桂超,湯健.  生物化學(xué)雜志. 1991(04)



本文編號(hào)：3181146