本文關(guān)鍵詞：FGFR3單鏈抗體和FGFR3單鏈抗體—魚精蛋白融合蛋白的原核表達(dá)、純化及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：成纖維細(xì)胞生長因子受體3（fibroblast growth factor receptor3, FGFR3）是FGFR家族的一員，與成纖維細(xì)胞因子特異性結(jié)合后，在細(xì)胞的增殖分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，越來越多文獻(xiàn)報道FGFR3的突變或過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。因此，F(xiàn)GFR3作為一個潛在的治療腫瘤的靶點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注，并且已經(jīng)有靶向FGFR3的藥物被成功研制并進(jìn)入二期臨床實驗。本課題中，我們設(shè)計了兩種蛋白：抗FGFR3的單鏈抗體（single chain fragment variable，ScFv）和ScFv與截短型魚精蛋白（truncated protamine，tp）的融合蛋白ScFv-tp。希望達(dá)到以下兩個目的：一、ScFv特異性結(jié)合FGFR3，并發(fā)揮生物學(xué)作用，拮抗FGFR3的磷酸化；二、融合蛋白ScFv-tp中，ScFv能夠特異性的結(jié)合FGFR3，是“定位裝置”，tp在中性條件下帶正電，能與帶負(fù)電的核酸結(jié)合，是“攜帶裝置”，用ScFv-tp將有生物學(xué)功能的siRNA（“殺傷裝置”）靶向運(yùn)送至FGFR3+腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而通過RNAi機(jī)制沉默相關(guān)基因，為FGFR3+腫瘤的靶向治療提供一種有效的方法。 通過PCR擴(kuò)增將ScFv與小泛素修飾復(fù)合物（Small ubiquitin-related modifierProteins，Sumo）分子伴侶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-20b-Sumo-ScFv，并在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。經(jīng)Ni柱親和層析純化、Sumo酶切和再純化，獲得抗FGFR3的單鏈抗體ScFv，蛋白純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)量可達(dá)到約4mg每升菌液。細(xì)胞實驗結(jié)果表明ScFv能夠特異性結(jié)合FGFR3，并抑制FGF9對FGFR3的磷酸化作用。 利用相同方法構(gòu)建融合蛋白ScFv-tp的表達(dá)載體pET-20b-Sumo-ScFv-tp，但獲得的融合蛋白ScFv-tp結(jié)合了過多菌體本身破碎時釋放的基因組DNA，影響后續(xù)實驗中siRNA的攜帶。為避免融合蛋白結(jié)合菌體DNA，我們采用了包涵體表達(dá)的策略。首先將Sumo去掉，構(gòu)建了融合蛋白ScFv-tp的表達(dá)載體pET-20b-ScFv-tp，并在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)。通過包涵體洗滌與變復(fù)性純化蛋白，并獲得重折疊的可溶性蛋白。蛋白純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)量可達(dá)到約10mg每升菌液。凝膠阻滯實驗結(jié)果表明，所得的ScFv-tp不帶有菌體DNA，而能夠結(jié)合siRNA，且此種結(jié)合作用有飽和性。流式細(xì)胞術(shù)檢測和免疫熒光檢測證實ScFv-tp能夠?qū)iRNA運(yùn)送至FGFR3+細(xì)胞K562和RT-112內(nèi)，而不能運(yùn)送至FGFR3-細(xì)胞THP-1內(nèi)。RT-PCR和Western Blot實驗結(jié)果表明通過ScFv-tp遞送入RT-112細(xì)胞的siRNA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了明顯的RNAi效應(yīng)，干擾了乳腺癌擴(kuò)增基因-1（amplified in breast cancer1，AIB1）的表達(dá)，使細(xì)胞中AIB1基因的mRNA和蛋白表達(dá)量明顯減低。 綜上所述，本研究首先在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并獲得了靶向FGFR3的單鏈抗體ScFv，且ScFv特異性結(jié)合FGFR3后能夠明顯抑制FGF9誘導(dǎo)的FGFR3的磷酸化作用；其次通過包涵體變復(fù)性的方法獲得了FGFR3的單鏈抗體ScFv與截短的魚精蛋白tp的融合蛋白ScFv-tp，該融合蛋白不僅能夠結(jié)合siRNA，而且能夠靶向性地將其運(yùn)送至FGFR3+細(xì)胞內(nèi)，并有效地發(fā)揮RNAi效應(yīng)將相關(guān)基因AIB1沉默。
【關(guān)鍵詞】：成纖維細(xì)胞生長因子受體3（FGFR3） 單鏈抗體（ScFv） 小分子干擾RNA（siRNA） 重組融合蛋白質(zhì) 原核表達(dá) 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-17
• 1.1 成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）及成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）11-12
• 1.2 單鏈抗體12
• 1.3 siRNA 與癌癥12-13
• 1.4 siRNA 的運(yùn)輸系統(tǒng)13-14
• 1.5 原核表達(dá)與 Sumo 表達(dá)系統(tǒng)14-15
• 1.6 課題設(shè)計思路15-17
• 第二章 實驗試劑、儀器及實驗步驟17-24
• 2.1 主要試劑17-18
• 2.2 實驗儀器18-19
• 2.3 實驗室常用溶液19-21
• 2.3.1 SDS-PAGE 試劑19
• 2.3.2 Western blot 試劑19
• 2.3.3 細(xì)菌培養(yǎng)基19-20
• 2.3.4 50×Tris-乙酸（TAE）20
• 2.3.5 Amp（100 mg/mL）貯存液20
• 2.3.6 蛋白純化相關(guān)緩沖液20-21
• 2.4 實驗室基本方法21-24
• 2.4.1 DNA 片段膠回收21
• 2.4.2 重組子轉(zhuǎn)化21
• 2.4.3 質(zhì)粒提取21-24
• 第三章 ScFv 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組 ScFv 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化24-36
• 3.1 實驗?zāi)康?/span>24
• 3.2 實驗方法24-30
• 3.2.1 ScFv 表達(dá)載體的構(gòu)建24-27
• 3.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化27-30
• 3.3 實驗結(jié)果30-35
• 3.3.1 Sumo 和 Sumo-ScFv 片段電泳結(jié)果30-31
• 3.3.2 重組質(zhì)粒酶切與測序鑒定31
• 3.3.3 重組蛋白 Sumo-ScFv 的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性表達(dá)情況31-32
• 3.3.4 重組蛋白 Sumo-ScFv 的純化32
• 3.3.5 重組蛋白 Sumo-ScFv 的 Western Blot 檢測32-33
• 3.3.6 融合蛋白 Sumo-ScFv 酶切及純化33
• 3.3.7 目的蛋白 ScFv 質(zhì)譜測序33-34
• 3.3.8 目的蛋白 ScFv 抑制 FGF9 誘導(dǎo)的 FGFR3 磷酸化的研究34-35
• 3.4 實驗小結(jié)35-36
• 第四章 融合蛋白 ScFv-tp 的表達(dá)、純化及功能研究36-49
• 4.1 實驗方法36-42
• 4.1.1 重組質(zhì)粒 pET-20b-ScFv-tp 表達(dá)載體的構(gòu)建36
• 4.1.2 ScFv-tp 融合蛋白的表達(dá)與獲得36-37
• 4.1.3 ScFv-tp 融合蛋白的鑒定37-38
• 4.1.4 ScFv-tp 融合蛋白結(jié)合 siRNA 能力的鑒定38
• 4.1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 入 K562 細(xì)胞的能力38
• 4.1.6 免疫熒光檢測 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 入 RT-112 細(xì)胞的能力38-39
• 4.1.7 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 對 RT-112 細(xì)胞在 mRNA 水平的影響39-41
• 4.1.8 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 對 RT-112 細(xì)胞在蛋白水平的影響41-42
• 4.2 實驗結(jié)果42-48
• 4.2.1 ScFv-tp 基因片段的 PCR 擴(kuò)增42
• 4.2.2 融合蛋白 ScFv-tp 的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性表達(dá)情況42-43
• 4.2.3 包涵體蛋白的純化與復(fù)性43
• 4.2.4 融合蛋白 ScFv-tp 的 Western Blot 鑒定43
• 4.2.5 ScFv-tp 融合蛋白的質(zhì)譜鑒定43-44
• 4.2.6 ScFv-tp 融合蛋白結(jié)合 siRNA 的能力檢測44
• 4.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 入 K562 細(xì)胞的能力44-45
• 4.2.8 免疫熒光檢測 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 入 RT-112 細(xì)胞的能力45-46
• 4.2.9 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 對 RT-112 細(xì)胞在 mRNA 水平的影響46-47
• 4.2.10 ScFv-tp 運(yùn)送 siRNA 對 RT-112 細(xì)胞在蛋白水平的影響47-48
• 4.3 實驗小結(jié)48-49
• 第五章 討論49-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 姚海蘭;肖宗慧;任紅雁;韓繼生;劉哲偉;;針對2B區(qū)域的短雙鏈RNA抑制柯薩奇B3病毒感染HeLa細(xì)胞的特性研究[J];病毒學(xué)報;2007年04期

2 王斌;湯華;;病毒對抗RNAi的方式[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2007年01期

3 Orawan Khow;Sunutcha Suntrarachun;;Strategies for production of active eukaryotic proteins in bacterial expression system[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2012年02期

4 Brittany C.Parker;Wei Zhang;;Fusion genes in solid tumors: an emerging target for cancer diagnosis and treatment[J];Chinese Journal of Cancer;2013年11期

5 Lalit Patel;Brittany Parker;Da Yang;Wei Zhang;;Translational genomics in cancer research: converting profiles into personalized cancer medicine[J];Cancer Biology & Medicine;2013年04期

6 陳泉;扈進(jìn)冬;趙曉燕;李哲;李紀(jì)順;楊合同;;天蠶素AD和BuforinⅡ表達(dá)載體的改良和融合蛋白表達(dá)條件優(yōu)化[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年12期

7 潘家茂;藍(lán)健益;鄭小群;秦秀林;馮家勛;劉君梁;;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠色木霉HP35-3轉(zhuǎn)化及表達(dá)體系的構(gòu)建[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2014年04期

8 李廣京;楊靜美;葉滔;胡安龍;;抗菌肽基因異源表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];廣東農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年17期

9 申培力;駱文龍;;絲裂霉素C預(yù)防家兔喉氣管狹窄的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2014年24期

10 Jie Chen;Zi-xue Jiao;Lin Lin;Zhao-pei Guo;Cai-na Xu;Yan-hui Li;田華雨;Xue-si Chen;;Polylysine-modified Polyethylenimines as siRNA Carriers for Effective Tumor Treatment[J];Chinese Journal of Polymer Science;2015年06期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 昌磊;萬特普安在膀胱癌中的抑癌效應(yīng)及分子機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2013年

2 倪長偉;抗MRP3單鏈抗體與sTRAIL融合蛋白的克隆表達(dá)及其對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的靶向凋亡誘導(dǎo)作用研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

3 郭旺明;重組大腸桿菌工業(yè)生產(chǎn)三種蛋白藥物過程中的關(guān)鍵技術(shù)[D];浙江大學(xué);2012年

4 胡林義;PI3K/Akt信號通路對非肌層浸潤性膀胱癌腫瘤復(fù)發(fā)和喜樹堿敏感性關(guān)系研究[D];浙江大學(xué);2013年

5 周霞;Fgfr2 S252W功能增強(qiáng)型突變對小鼠下頜骨及牙齒影響研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

6 王崧;新型促血小板生成融合蛋白的基因工程制備及其作用機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

7 謝楊麗;FGFR3在骨骼發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持中的作用與相關(guān)機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

8 王珂楠;樹膠脂毒素對人膀胱癌RT4細(xì)胞抑制作用的體外研究[D];中南大學(xué);2013年

9 郭久冰;SLPI在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其腫瘤生物學(xué)功能的初步研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

10 慕天陽;基質(zhì)金屬蛋白酶26的原核表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)鑒定[D];吉林大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：FGFR3單鏈抗體和FGFR3單鏈抗體—魚精蛋白融合蛋白的原核表達(dá)、純化及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：313402