本文關(guān)鍵詞：抗CD133納米抗體的制備及細(xì)胞毒性肽的活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目前傾向于認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是惡性腫瘤難治和對(duì)化療耐藥的根源之一。因此,對(duì)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志分子的鑒定和功能研究,以及開(kāi)發(fā)基于這些分子的靶向藥物成為提高腫瘤治療效果的手段之一。CD133是一個(gè)五次跨膜糖蛋白,在多種惡性腫瘤細(xì)胞以及腫瘤干細(xì)胞表面高表達(dá),是鑒定腫瘤干細(xì)胞最常用的標(biāo)志物之一。目前獲得的抗CD133的抗體包括AC133、293C3和AC141等主要用于鑒別CD133+表達(dá)的干細(xì)胞亞群,并不具有對(duì)腫瘤干細(xì)胞的治療作用。因此,有必要開(kāi)發(fā)靶向CD133并具有治療作用的新抗體藥物。由于當(dāng)前對(duì)CD133分子在干細(xì)胞中的生物學(xué)功能不甚了解,對(duì)設(shè)計(jì)靶向CD133的功能性抗體帶來(lái)了困難。所以,當(dāng)前靶向CD133治療抗體的主要策略是與細(xì)胞毒性藥物進(jìn)行偶聯(lián)。其中一種方法是與細(xì)胞毒性肽,如大腸桿菌毒素分子(Colicin Ia)、蛙皮素抗菌肽(Brevinin-2R)、假單胞菌外毒素A-PE38以及KDEL肽,進(jìn)行分子融合或偶聯(lián)。另外,直接在抗體分子上偶聯(lián)毒性更強(qiáng)的化療藥物,如單甲基澳瑞他汀等,越來(lái)越成為制備抗體-藥物偶聯(lián)物的主要趨勢(shì)。已有研究表明,這些細(xì)胞毒制劑與抗CD133抗體融合可以顯著地抑制多種腫瘤組織及腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)。納米抗體是在駱駝科動(dòng)物免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的天然缺失輕鏈的重鏈抗體可變區(qū)片段,是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子,具有水溶性高、制備成本低和可結(jié)合常規(guī)抗體不易結(jié)合抗原表位等優(yōu)點(diǎn)。在制備抗體-藥物偶聯(lián)物中,因納米抗體的單域抗體特性,偶聯(lián)藥物后對(duì)其抗原結(jié)合活性影響甚微。這使得納米抗體在制備抗體-藥物偶聯(lián)物中更具優(yōu)勢(shì)。因此,本研究的目的在于獲得高親和力的抗CD133的納米抗體并與Colicin Ia蛋白或Brevinin-2R分子進(jìn)行偶聯(lián)或分子融合制備抗體-毒素復(fù)合物,以期將抗體的靶向作用與毒素分子的抗腫瘤作用結(jié)合起來(lái),從而獲得一種對(duì)腫瘤及其干細(xì)胞具有顯著殺傷作用的治療制劑�；诖�,本研究首先采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建包含CD133胞外區(qū)(CD133-ECD)的原核表達(dá)載體pET28a-CD133-ECD。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CD133-ECD蛋白,采用Ni-離子親和色譜純化誘導(dǎo)表達(dá)的CD133-ECD蛋白。將純化蛋白對(duì)新西蘭兔和新疆雙峰駝進(jìn)行免疫,以獲得兔源和駱駝源抗CD133-ECD蛋白的多克隆抗體,用于分析抗體對(duì)CD133蛋白的結(jié)合情況。其次,從新疆雙峰駝駱駝外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA,構(gòu)建駱駝納米抗體噬菌體展示文庫(kù),并用純化的CD133-ECD蛋白對(duì)噬菌體展示文庫(kù)進(jìn)行親和篩選以得到對(duì)CD133-ECD有結(jié)合力的候選抗體。進(jìn)一步,采用ELISA和Western blot方法對(duì)獲得的候選納米抗體的抗原結(jié)合活性進(jìn)行鑒定。最后,采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)重組表達(dá)獲得的Colicin Ia和Brevinin-2R毒性蛋白分子對(duì)B16細(xì)胞、Skov-3細(xì)胞和Caov-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用進(jìn)行檢測(cè),為將來(lái)制備抗體與細(xì)胞毒性肽的偶聯(lián)或融合物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明,原核表達(dá)載體pET28a-CD133經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá),獲得了純度大于90%的CD133-ECD重組蛋白,從免疫的家兔和駱駝血清中獲得了效價(jià)分別為1:500000和1:1024000的抗CD133-ECD多克隆抗體。兩種多抗在ELISA檢測(cè)中均與CD133-ECD有特異結(jié)合作用。采用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了庫(kù)容量為1.4×109 cfu的單域抗體庫(kù)。菌落PCR和序列測(cè)定均表明該抗體庫(kù)具有95%以上的多樣性。采用親和淘洗經(jīng)過(guò)三輪篩選。從第三輪篩選獲得的噬菌體克隆中經(jīng)過(guò)菌落PCR和序列分析,選擇了3株陽(yáng)性噬菌體克隆并亞克隆到p ET28a表達(dá)載體中,在大腸桿菌BL21細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化了獲得了VHH-13納米抗體利用ELISA檢測(cè)抗體的抗原特異性,發(fā)現(xiàn)VHH-13納米抗體與CD133-ECD蛋白具有特異結(jié)合活性。另外,采用CCK-8檢測(cè)結(jié)果表明Colicin Ia蛋白對(duì)Cavo-3細(xì)胞、Skov-3細(xì)胞、B16細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用,Brevinin-2R對(duì)Skov-3細(xì)胞、B16細(xì)胞有顯著抑制作用。本研究通過(guò)噬菌體展示技術(shù)獲得了一株對(duì)CD133-ECD蛋白具有特異結(jié)合活性的納米抗體VHH-13,通過(guò)DNA重組技術(shù)獲得了對(duì)幾種腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用的Brevinin-2R肽分子。這些結(jié)果為進(jìn)一步制備納米抗體-毒性分子偶聯(lián)物,及開(kāi)展抗腫瘤及干細(xì)胞抑制作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為開(kāi)發(fā)新一代抗體藥物奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：納米抗體 噬菌體展示技術(shù) CD133 Brevinin-2R 抗腫瘤作用
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文縮略詞7-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述12-24
• 第一章 腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系12-20
• 1 腫瘤干細(xì)胞12
• 2 TICs與微環(huán)境之間的關(guān)系12-13
• 3 TICs的多種表面標(biāo)志物13-14
• 4 CD133結(jié)構(gòu)及表面標(biāo)志物14-16
• 5 靶向TICs標(biāo)志物的研究進(jìn)展16-17
• 參考文獻(xiàn)17-20
• 第二章 抗體-藥物融合物導(dǎo)向治療研究概況20-24
• 1 抗體簡(jiǎn)介20
• 2 ADCs的研究進(jìn)展20-21
• 3 Colicin Ia及蛙皮抗菌肽簡(jiǎn)介21-22
• 參考文獻(xiàn)22-24
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究24-69
• 第一章 抗CD133胞外區(qū)駱駝多克隆抗體的制備及鑒定24-32
• 摘要24-25
• 1 材料與方法25-27
• 1.1 材料25-26
• 1.2 方法26-27
• 2 結(jié)果27-30
• 2.1 重組質(zhì)粒pET28a-CD133的構(gòu)建與鑒定27
• 2.2 CD133-606的原核表達(dá)及融合蛋白的純化27-28
• 2.3 抗體效價(jià)的測(cè)定28-29
• 2.4 Western Blot檢測(cè)多抗的特異結(jié)合活性29-30
• 3 討論30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 第二章 非免疫駱駝單域抗體庫(kù)的構(gòu)建及篩選32-49
• 摘要32
• 1 材料32-33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-40
• 2.1 新疆雙峰駝天然抗體庫(kù)的構(gòu)建及評(píng)估33-38
• 2.2 駱駝重鏈抗體天然噬菌體展示文庫(kù)的表達(dá)38-39
• 2.3 CD133-606抗原蛋白對(duì)噬菌體展示文庫(kù)的篩選39-40
• 3 結(jié)果40-46
• 3.1 駱駝VHH抗體基因的準(zhǔn)備：40-41
• 3.2 pMECS載體的準(zhǔn)備41-42
• 3.3 轉(zhuǎn)化效率計(jì)算和駱駝天然抗體庫(kù)庫(kù)容估算42-43
• 3.4 新疆雙峰駝噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建及篩選43-46
• 4 討論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 第三章 抗CD133_(-606)納米抗體的初步鑒定49-62
• 摘要49-50
• 1 材料50-51
• 1.1 菌種及載體50
• 1.2 試劑50
• 1.3 培養(yǎng)基及溶液配制50-51
• 1.4 亞克隆引物設(shè)計(jì)51
• 2 方法51-55
• 2.1 小量誘導(dǎo)TG1-pMECS-VHH-X表達(dá)蛋白51
• 2.2 小量誘導(dǎo)HB2151-pMECS-VHH-X表達(dá)VHH蛋白51
• 2.3 小量誘導(dǎo)BL21-pMECS-VHH-X表達(dá)VHH蛋白51
• 2.4 重復(fù)序列測(cè)序51-52
• 2.5 驗(yàn)證VHH-02抗體蛋白與CD133蛋白結(jié)合活性52-54
• 2.6 構(gòu)建pET28a-VHH07，，pET28-VHH13，pET28a-VHH35重組載體54-55
• 3.結(jié)果55-59
• 3.1 VHH-02蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化55
• 3.2 三輪篩選獲得的重復(fù)序列的亞克隆55-59
• 4 討論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 第四章 大腸桿菌毒素分子和蛙皮素抗菌肽誘導(dǎo)表達(dá)及毒性檢測(cè)62-69
• 摘要62-63
• 1 材料63-64
• 1.1 菌種和腫瘤細(xì)胞株63
• 1.2 試劑63
• 1.3 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑63-64
• 2 方法64
• 2.1 誘導(dǎo)表達(dá)Colicin Ia蛋白和Brevinin-2R蛋白表達(dá)及純化64
• 2.2 CCK-8 檢測(cè)Colicin Ia蛋白及Brevinin-2R對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用64
• 3 結(jié)果64-66
• 3.1 Colicin Ia蛋白的表達(dá)純化65
• 3.2 Brevinin-2R蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)65-66
• 3.3 CCK-8 檢測(cè)兩種細(xì)胞毒性肽對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用66
• 4 討論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-69
• 總結(jié)69-70
• 展望70-71
• 致謝71-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷72
• 參與課題及發(fā)表文章72-73
• 參與課題72-73

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 何蓮;劉騫;馮濟(jì)龍;黃波;;腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4和ALDH1A1在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];解剖學(xué)研究;2014年05期

2 孫明立;趙海山;肖慶環(huán);于兆進(jìn);姚維凡;唐宏濤;關(guān)舒;金鋒;魏敏杰;;ALDH1A1在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及臨床意義[J];解剖學(xué)研究;2015年03期

3 李志鵬;李p

本文編號(hào)：309384