目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除巴馬小型豬4-羥基苯丙酮酸氧化酶（4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/HPD）制備高酪氨酸血癥Ⅲ型巴馬小型豬模型。方法分別從質(zhì)粒pGL3-U6-gRNA-PGK-puromycin和pST1374-NLS-flag-linker-Cas9中通過PCR擴(kuò)增sgRNA-Hpd和Cas9體外轉(zhuǎn)錄用模板,接著體外轉(zhuǎn)錄出Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd,最后將Cas9 mRNA和sgRNA-Hpd共注射入巴馬小型豬受精卵的胞質(zhì)內(nèi),以制備Hpd基因敲除巴馬小型豬。結(jié)果胞質(zhì)內(nèi)共注射后,共移植20枚受精卵至2只代孕母豬。獲得子代Hpd基因敲除巴馬小型豬共4只。結(jié)論本研究成功制備了高酪氨酸血癥Ⅲ型巴馬小型豬模型,將為研究酪氨酸代謝通路提供更好的模型。 

【文章來源】：中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2019,29(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 實驗材料
        1.1.1 實驗動物
        1.1.2 載體
    1.2 主要試劑與儀器
    1.3 實驗方法
        1.3.1 SgRNA-Hpd和Cas9 mRNA獲取
        1.3.2 巴馬小型豬同步發(fā)情與受精卵獲取
        1.3.3 Cas9 mRNA和sgRNA的受精卵胞質(zhì)內(nèi)共注射
        1.3.4 胚胎移植及妊娠檢測
        1.3.5 基因型鑒定
        1.3.6 蛋白表達(dá)水平檢測
        1.3.7 血液氨基酸檢測
            （1） 樣品采集:
            （2） 樣品處理方法:
            （3） 數(shù)據(jù)分析:
        1.3.8 尿液酪氨酸代謝產(chǎn)物檢測
            （1） 尿樣采集和預(yù)處理:
            （2） 樣品處理方法:
            （3） 色譜及質(zhì)譜條件:
2 結(jié)果
    2.1 sgRNA設(shè)計及Cas9 mRNA和sgRNA制備
    2.2 受精卵胞質(zhì)內(nèi)共注射Cas9 mRNA和sgRNA建立HPD基因修飾巴馬小型豬
    2.3 基因型鑒定
    2.4 HPD蛋白表達(dá)
    2.5 血液酪氨酸水平
    2.6 尿液氨基酸代謝產(chǎn)物含量
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]新生兒苯丙酮尿癥兩種實驗室篩查方法的質(zhì)量評價[J]. 田國力,許洪平,朱偉明,管翌華,王燕敏.  檢驗醫(yī)學(xué). 2007(02)



本文編號：3062373