目的構(gòu)建豬帶絳蟲(chóng)TSOL18重組恥垢分枝桿菌疫苗,分析豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因在重組恥垢分枝桿菌中的表達(dá)情況。方法采用PCR方法從重組質(zhì)粒pGEX-TSOL18中擴(kuò)增TSOL18基因,克隆入pMV361載體,構(gòu)建pMV361-TSOL18穿梭質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后電穿孔法轉(zhuǎn)化入恥垢分枝桿菌,進(jìn)行單克隆菌落篩選及PCR鑒定。構(gòu)建的豬帶絳蟲(chóng)TSOL18重組恥垢分枝桿菌疫苗經(jīng)熱誘導(dǎo)后,以SDS-PAGE分析及Western blot分析TSOL18基因在重組恥垢分枝桿菌中的表達(dá)情況。結(jié)果成功擴(kuò)增出TSOL18目的基因,大小約為393 bp,與預(yù)期值相符;經(jīng)酶切驗(yàn)證,pMV361-TSOL18穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功;PCR鑒定豬帶絳蟲(chóng)TSOL18重組恥垢分枝桿菌疫苗構(gòu)建成功。SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組菌表達(dá)的目的蛋白TSOL18,相對(duì)分子質(zhì)量為15×10³與預(yù)期相符;Western blot分析該蛋白能被TSOL18兔抗血清識(shí)別。結(jié)論成功構(gòu)建了豬帶絳蟲(chóng)TSOL18重組恥垢分枝桿菌疫苗,豬帶絳蟲(chóng)TSOL18基因在恥垢分枝桿菌中成功表達(dá),表達(dá)蛋白具有反應(yīng)原性,其免疫原性有待進(jìn)一... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2019,14(06)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

圖１ＴＳＯＬ１８基因ＰＣＲ擴(kuò)增ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆＴＳＯＬ１８ＭＤＮＡ標(biāo)志物１ＴＳＯＬ１８基因ＰＣＲ產(chǎn)物

ＭＤＮＡ標(biāo)志物１雙酶切產(chǎn)物圖２重組質(zhì)粒ｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８的雙酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰｒｏｄｕｃｔｏｆｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＦｉｇ．２ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８３豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌疫苗的ＰＣＲ鑒定挑取重組菌單菌落于３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩條件下繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至Ａ６００值Ｄ約１．０，吸取經(jīng)高溫裂解的上清液作為模板進(jìn)行ＰＣＲ，結(jié)果見(jiàn)圖３，擴(kuò)增片段大小與ＴＳＯＬ１８基因理論值相符。ＭＤＮＡ標(biāo)志物１～５５個(gè)重組菌單菌落的ＰＣＲ產(chǎn)物圖３ｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌菌落ＰＣＲ檢測(cè)ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１－５ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ５ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙＦｉｇ．３ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８ｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ４豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌表達(dá)產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析取鑒定陽(yáng)性的重組菌單克隆菌落接種于Ｍ７Ｈ９ＡＤＣ液體培養(yǎng)基，經(jīng)４５℃熱誘導(dǎo)４５ｍｉｎ后超聲破菌離心，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，結(jié)果見(jiàn)圖４。Ｍ蛋白標(biāo)志物１重組菌熱誘導(dǎo)前總蛋白２重組菌熱誘導(dǎo)后總蛋白３重組菌熱誘導(dǎo)后沉淀４重組菌熱誘導(dǎo)后上清圖４豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｂｅｆｏｒｅｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ２Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎａｆｔ

ｒｋｅｒ１ＰｒｏｄｕｃｔｏｆｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎＦｉｇ．２ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８３豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌疫苗的ＰＣＲ鑒定挑取重組菌單菌落于３７℃、１５０ｒ／ｍｉｎ振蕩條件下繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至Ａ６００值Ｄ約１．０，吸取經(jīng)高溫裂解的上清液作為模板進(jìn)行ＰＣＲ，結(jié)果見(jiàn)圖３，擴(kuò)增片段大小與ＴＳＯＬ１８基因理論值相符。ＭＤＮＡ標(biāo)志物１～５５個(gè)重組菌單菌落的ＰＣＲ產(chǎn)物圖３ｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８質(zhì)粒轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌菌落ＰＣＲ檢測(cè)ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ１－５ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ５ｓｉｎｇｌｅｃｏｌｏｎｙＦｉｇ．３ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐＭＶ３６１－ＴＳＯＬ１８ｐｌａｓｍｉｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ４豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌表達(dá)產(chǎn)物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析取鑒定陽(yáng)性的重組菌單克隆菌落接種于Ｍ７Ｈ９ＡＤＣ液體培養(yǎng)基，經(jīng)４５℃熱誘導(dǎo)４５ｍｉｎ后超聲破菌離心，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，結(jié)果見(jiàn)圖４。Ｍ蛋白標(biāo)志物１重組菌熱誘導(dǎo)前總蛋白２重組菌熱誘導(dǎo)后總蛋白３重組菌熱誘導(dǎo)后沉淀４重組菌熱誘導(dǎo)后上清圖４豬帶絳蟲(chóng)ＴＳＯＬ１８重組恥垢分枝桿菌ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｂｅｆｏｒｅｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ２Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎａｆｔｅｒｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ３Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｆｔｅｒｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[10]豬帶絳蟲(chóng)重組抗原研究進(jìn)展[J]. 周必英.  中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào). 2014(04)



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