本文關鍵詞：重組人甘露聚糖結合凝集素相關蛋白19的表達與初步鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：補體系統(tǒng)是機體固有免疫的重要組成部分,可通過經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑而被激活,發(fā)揮其生物學效應。啟動凝集素途徑活化的第一個補體組分是甘露糖結合凝集素(mannan-binding lection,MBL)/纖維膠原素(ficolin,FCN)與MBL-相關絲氨酸蛋白酶(mannose-binding lectin associated serine protease,MASP)結合形成的復合物。MASP家族由MASP-1、MASP-2、MASP-3絲氨酸蛋白酶及MAp19和MAp44非酶蛋白組成,其中MASP-2是參與凝集素途徑活化的重要組分。MAp19是MASP-2的剪切體,其氨基酸序列分析顯示僅比MASP-2羧基端前兩個功能區(qū)多四個氨基酸殘基。MAp19能與MBL結合,但無催化功能,它是否與MASP-2存在競爭抑制作用尚待進一步研究證實。此外發(fā)現(xiàn)MAp19與腎病、骨髓瘤以及SARS等疾病存在一定相關性。本課題擬在構建pcDNA3.1/Myc-HisA-MAp19真核表達載體,表達的重組MAp19蛋白,為后續(xù)研究其功能奠定基礎。首先應用PCR技術擴增得到MAp19基因。采用切膠回收的方法純化PCR產(chǎn)物。將MAp19片段和真核表達載體pcDNA3.1/Myc-His A進行BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切凝膠回收各片段。將MAp19片段和真核表達載體pc DNA3.1/Myc-His A的酶切產(chǎn)物以T4連接酶進行連接。將MAp19重組質粒采用熱休克法導入感受態(tài)細菌E.coli BL21中,將菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)板上培養(yǎng)過夜。采用MAp19特異性引物及pcDNA3.1/Myc-His A通用引物進行Cross-PCR初篩LB平板上長出的單個菌落,并進行BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定。將鑒定正確的重組質粒進行測序。測序結果與Genbank公示的MAp19標準序列比對完全一致,未發(fā)現(xiàn)移碼現(xiàn)象,即成功構建pcDNA3.1/Myc-HisAMAp19重組真核表達載體。確定重組真核載體構建成功后,將其通過脂質體介導技術轉染到HeLa細胞中。48h后,細胞固定、封閉、用鼠抗c-Myc抗體孵育后再經(jīng)過Alexa Flour488標記羊抗小鼠IgG(H+L)染色,熒光顯微鏡下觀察MAp19在細胞內的表達。設置不同梯度濃度的G418選擇培養(yǎng)基,確定G418對HeLa細胞的最小藥物致死濃度。并采用該濃度的G418選擇性培養(yǎng)基對轉染后的HeLa細胞進行選擇性培養(yǎng),選擇熒光較強的HeLa細胞經(jīng)有限稀釋,持續(xù)篩選及克隆化培養(yǎng),從而獲得整合有pcDNA3.1/Myc-HisA-MAp19的陽性細胞克隆再進行擴大培養(yǎng)。收集細胞培養(yǎng)上清及細胞裂解液,經(jīng)Anti-c-Myc agarose翻轉吸附純化,而后進行Western blot,用鼠抗c-Myc抗體以及HRP標記山羊抗鼠IgG孵育,結果可見轉染了重組質粒的細胞培養(yǎng)上清和裂解液中有陽性條帶,分子量約為19.84KDa,與c-Myc-HisA-MAp19融合蛋白分子質量大小相符,提示該融合蛋白成功表達。
【關鍵詞】：MAp19 真核表達 HeLa細胞 篩選
【學位授予單位】：河北北方學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R3411
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮寫10-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-30
• 結果30-33
• 附圖33-42
• 討論42-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-52
• 綜述 甘露聚糖結合凝集素相關蛋白19的研究進展52-62
• 參考文獻58-62
• 致謝62-63
• 個人簡歷63

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本文編號：301352