背景：弓形蟲（Toxoplasma gondii）為專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，全球分布，能引起人獸共患的弓形蟲病，全世界約1／3人口感染，大多數(shù)為隱形感染，但對于孕婦和免疫功能抑制或低下者，能造成嚴(yán)重危害，孕婦感染常引起流產(chǎn)、畸胎、死胎等，對于腫瘤患者或AIDS病人等免疫功能受損者，弓形蟲是引起死亡的主要病原體之一。同時，弓形蟲對畜牧業(yè)生產(chǎn)也造成了嚴(yán)重危害。因此，弓形蟲病的診斷和疫苗研究成為弓形蟲病防治工作的重點(diǎn)。篩選和獲得敏感性好、特異度高的抗原是診斷和疫苗研究的基礎(chǔ)。SAG1蛋白為弓形蟲速殖子期特異性抗原，ROP2蛋白為弓形蟲生活史各期均分泌的抗原，具有高度的保守性和免疫原性，已成為弓形蟲病診斷和疫苗研究的候選分子。 目的：分別克隆和表達(dá)SAGI和 ROPZ基因，篩選診斷抗原；構(gòu)建SAGI八 復(fù)合基因，進(jìn)行疫苗研究。 方法：1．利用PCR技術(shù)從弓形蟲基因組中擴(kuò)增出ROPZ基因，并將其克隆到PGEX個Tl進(jìn)行表達(dá)和鑒定。 2．通過PCR將SAGI基因從弓形蟲基因組中調(diào)出，并克隆到pGEX－4T－1和pET32a中分別進(jìn)行表達(dá)和鑒定。 3．通... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

重組質(zhì)粒pGEX一4T一1一ROPZ的酶切及PCR鑒定M:分子最標(biāo)準(zhǔn);1:EeoRI酶切pGEX一4T一l;2:EeoRI酶切pGEX一4‘r一l一R()PZ;3:ECoRI+Sall雙酶切pGEX一4T一l一ROPZ;4:pGEX一4T一l一ROPZ質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;5:

}}}1582CGG圖1一4克隆的ROPZ基因序列與己發(fā)表的ROPZ基因序列的比較上行:克隆的ROPZ基因序列;下行:己發(fā)表的ROPZ基因序列Fig.1一4AlignmentofnueledtidesequeneeoftheelonedropZgeneandtherePortedroPZgeneUpperline:theelonedropZgene:lowerline:thereportedropZgene.四、弓形蟲ROPZ基因在大腸桿菌中的表達(dá)(一)ROPZ基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)工PTG誘導(dǎo)，弓形蟲ROPZ基因以融合蛋白的形式在大腸桿菌中得到了表達(dá)。通過SDS一PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)融合表達(dá)產(chǎn)物大小為55Kda，與理論值基本吻合，而空載體在26Kda的位置表達(dá)了GST擔(dān)體蛋白。234563一，.刃j目自巨上﹃﹃︺-三竺叢翅魚魚魚違L三塵魚圖1一5重組蛋白GST/ROPZ的SnS一PAGE分析

量標(biāo)準(zhǔn);l:未誘導(dǎo)的BL21(DE3);2:誘導(dǎo)后的BL21(DE3);34T一1/BLZI;4:誘導(dǎo)后的pGEX一4T一l/BL21;5:未誘導(dǎo)的pGEX一ROPZ/BL21;誘導(dǎo)后的pGEX一4T一1一ROPZ/BLZI1一5SDS一PAGEanalysisofthereeombinantproteinGST/ROeinmarker:Lane1BL21(DE3)withoutinduetion;Lane2BLetion:Lane3pGEX一4T一1/BLZIwithoutinduetion:Lane4prinduetion:Lane5pGEX一4T一1一ROPZ/BL21withoutinduetio6pGEX一4T一1一ROPZ/BL21afterinduetion.條件的優(yōu)化:機(jī)菌生長的不同時期(OD600分別為0.1，0.2，0.4，0.6，組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，工PTG終濃度為0.Ilnlnol/L，誘導(dǎo)導(dǎo)溫度為37℃。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS--隊(duì)GE電泳染色后，同情況下，以0D60。值為0.6時開始誘導(dǎo)表達(dá)效果較:100稀釋培養(yǎng)2.5h左右)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]對國內(nèi)幾種弓形蟲IgG抗體檢測試劑盒的再評估[J]. 于恩庶,甘紹伯.  中國人獸共患病雜志. 2001(04)
[2]對國內(nèi)市售弓形蟲病診斷試劑盒的評價(jià)和建議[J]. 于恩庶.  中國人獸共患病雜志. 2001(03)
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[4]弓形蟲復(fù)合抗原基因SAG1/ROP1在大腸桿菌中表達(dá)的初步研究[J]. 陳海峰,陳觀今,郭虹,鄭煥欽,王又紅.  中國人獸共患病雜志. 2001(02)
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[6]弓形蟲巢式PCR體系的建立及其對人、鼠弓形蟲病的檢測[J]. 陳曉光,劉國章,唐銀明,陳兆明.  中國寄生蟲病防治雜志. 1996(01)
[7]應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)建立弓形蟲表面抗原基因的克隆與測定[J]. 陳曉光,江靜波.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 1994(02)



本文編號：3002041