降鈣素是一種重要的肽類激素，在肌體的鈣磷代謝，骨的形成、分化和發(fā)育等相關(guān)的諸多環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵性作用。降鈣素在臨床上應(yīng)用十分廣泛，但其自然來(lái)源有限，必須以基因工程手段進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)才能滿足需求。原核系統(tǒng)中表達(dá)出的降鈣素?zé)o法完成C-末端的酰胺化，尚需體外處理才能具有較強(qiáng)的生物活性。 本文利用PCR技術(shù)擴(kuò)增新型人降鈣素基因編碼序列hCT（將編碼C-末端脯氨酸的密碼子換為編碼谷氨酰氨的密碼子），將此基因克隆入大腸桿菌非融合型表達(dá)載體pBV220及融合型表達(dá)載體pET42a中。重組表達(dá)載體pET42a／hCT轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）plys中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)細(xì)胞裂解物中含有與預(yù)期位置相同的融合蛋白，經(jīng)Western Blot鑒定證明此融合蛋白具有人降鈣素的免疫活性。表達(dá)條件優(yōu)化后，可溶性蛋白的表達(dá)量占胞內(nèi)總蛋白的10％。經(jīng)超濾濃縮后，融合蛋白在Xa因子作用下產(chǎn)生重組的新型降鈣素，進(jìn)一步分離純化得到該蛋白的初級(jí)純品。大鼠體內(nèi)降血鈣試驗(yàn)表明新型降鈣素具有降血鈣活性。 

【文章來(lái)源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

PCR擴(kuò)增hCT*基因片段、hCT*:

1、DNAmarke750、5002、PCR擴(kuò)增圖1:PCR擴(kuò)增hCT*基因片段二、hCT*原核非融合表達(dá)載體的構(gòu)建:(一)重組質(zhì)粒PBV22O/hCT*的酶切鑒定:重組質(zhì)電泳可見(jiàn)約3.7Kbp和約IOObpZ條片段，以PB對(duì)照酶切產(chǎn)物只見(jiàn)3.7Kbp一條片段，與預(yù)期結(jié)有約IO0bp目的片段的插入。123

表1hCT含量的放免測(cè)定樣品放免測(cè)定重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物1.472x空質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物O88x由表1可見(jiàn)，重組質(zhì)粒PBV22O/hCT*表達(dá)但產(chǎn)量很低，我們認(rèn)為這是大部分表達(dá)產(chǎn)物被四、PCR擴(kuò)增新型人降鈣素基因hCT*延長(zhǎng)片段第一步PCR擴(kuò)增出與預(yù)期位置符合的約5擴(kuò)增出與預(yù)期位置符合的約543bp片段。1231、第二

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：2991927