白細胞介素—6在細胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中具有多種生物功能，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染等功能外，還對造血系統(tǒng)有著顯著的調(diào)節(jié)作用，特別是對機體血小板的恢復(fù)及骨髓造血功能的重建具有一定的臨床應(yīng)用價值。目前國外開發(fā)重組人IL-6已進入Ⅱ期臨床試驗。我國也將IL-6的開發(fā)列為重點項目。 IL-6在體內(nèi)可由多種細胞產(chǎn)生，如外周血單核細胞、成纖維細胞等。其前體由212個氨基酸構(gòu)成，成熟肽為184個氨基酸，分子量為21KD—28KD，有兩個糖基化位點，但糖基化與否并不影響其生物學活性，有4個半胱氨酸構(gòu)成的2對二硫鍵對其生物學活性極為重要。 為了能開發(fā)出自己的rhIL-6，我們對IL-6進行了基因克隆、表達調(diào)控和中試生產(chǎn)的試探性研究。 從PHA誘導的健康人外周血分離的單核細胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR方法克隆了人IL-6 cDNA，DNA序列測定發(fā)現(xiàn)除第289位堿基是C與文獻報導不同外（國外報導該位點為T），其余順序與國外報導一致。我們用定點誘變PCR的方法成功地將該位點進行了回復(fù)突變，將誘變后的基因插入到pBV220表達載體，并對其SD序列到ATG之間的距離進行了調(diào)控研究。將構(gòu)建的... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

總RNA的凝膠電泳圖

3結(jié)果3.1細胞總NRA的抽提與RT一pCR采用硫氰酸法抽提的總RNA在1%的瓊脂糖凝膠上的可見清晰的185、285RNA條帶，且285:185欲:1，說明提取的總RNA是完整的(見圖3)。接前面介紹的方法，經(jīng)RT一PCR后得到一約o.56kb的擴增產(chǎn)物(見圖4)，與文獻報導的LI一6DcNA大小相符。RT一PCR的引物由本室合成引物15’一GGAATTCACTAGTATGCCAGTACCCCA口GAGAA一3‘Eco班Spel幾一65，端順序引物25，一CG右GATCCTTACATTTGCCGAAGAGCCC一3‘BamHlLl一63’端順序

PUC18載體中.酶切結(jié)果RT一PCR打’‘J鐘產(chǎn)物RI+Banl卜11圖5pUC18一IL一6質(zhì)粒構(gòu)建方s.CnosrtuctionsehemeofPlasnndPJ.孟2一M一


本文編號：2991799