白細(xì)胞介素—6在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中具有多種生物功能，除具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗感染等功能外，還對(duì)造血系統(tǒng)有著顯著的調(diào)節(jié)作用，特別是對(duì)機(jī)體血小板的恢復(fù)及骨髓造血功能的重建具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前國(guó)外開發(fā)重組人IL-6已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。我國(guó)也將IL-6的開發(fā)列為重點(diǎn)項(xiàng)目。 IL-6在體內(nèi)可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，如外周血單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。其前體由212個(gè)氨基酸構(gòu)成，成熟肽為184個(gè)氨基酸，分子量為21KD—28KD，有兩個(gè)糖基化位點(diǎn)，但糖基化與否并不影響其生物學(xué)活性，有4個(gè)半胱氨酸構(gòu)成的2對(duì)二硫鍵對(duì)其生物學(xué)活性極為重要。 為了能開發(fā)出自己的rhIL-6，我們對(duì)IL-6進(jìn)行了基因克隆、表達(dá)調(diào)控和中試生產(chǎn)的試探性研究。 從PHA誘導(dǎo)的健康人外周血分離的單核細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR方法克隆了人IL-6 cDNA，DNA序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)除第289位堿基是C與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不同外（國(guó)外報(bào)導(dǎo)該位點(diǎn)為T），其余順序與國(guó)外報(bào)導(dǎo)一致。我們用定點(diǎn)誘變PCR的方法成功地將該位點(diǎn)進(jìn)行了回復(fù)突變，將誘變后的基因插入到pBV220表達(dá)載體，并對(duì)其SD序列到ATG之間的距離進(jìn)行了調(diào)控研究。將構(gòu)建的... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：95 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

總RNA的凝膠電泳圖

3結(jié)果3.1細(xì)胞總NRA的抽提與RT一pCR采用硫氰酸法抽提的總RNA在1%的瓊脂糖凝膠上的可見清晰的185、285RNA條帶，且285:185欲:1，說明提取的總RNA是完整的(見圖3)。接前面介紹的方法，經(jīng)RT一PCR后得到一約o.56kb的擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖4)，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的LI一6DcNA大小相符。RT一PCR的引物由本室合成引物15’一GGAATTCACTAGTATGCCAGTACCCCA口GAGAA一3‘Eco班Spel幾一65，端順序引物25，一CG右GATCCTTACATTTGCCGAAGAGCCC一3‘BamHlLl一63’端順序

PUC18載體中.酶切結(jié)果RT一PCR打’‘J鐘產(chǎn)物RI+Banl卜11圖5pUC18一IL一6質(zhì)粒構(gòu)建方s.CnosrtuctionsehemeofPlasnndPJ.孟2一M一


本文編號(hào)：2991799