本研究中，將丙型肝炎病毒(HCV)基因組的5’非編碼區(qū)(5’UTR)插入到報告基因綠色熒光蛋白(eGFP)和熒光素酶(luciferase)的上游，并構(gòu)建基于真核細(xì)胞Ⅲ型啟動子的表達(dá)載體，這種載體能產(chǎn)生針對HCV5’UTR的小干擾RNA(siRNA)。然后將含有HCV 5’UTR的eGFP／luciferase和能產(chǎn)生小于擾RNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，通過測定細(xì)胞發(fā)出的熒光和化學(xué)發(fā)光強(qiáng)弱來觀測抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HCV 5’UTR特異性小干擾RNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無論從定性還是從定量上所測得的熒光和化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度都明顯低于陰性對照，且細(xì)胞密度經(jīng)核染色與對照組無明顯區(qū)別。這揭示了小干擾RNA確實(shí)能引起HCV特異基因如5’UTR的沉默，且轉(zhuǎn)染進(jìn)去的小干擾RNA表達(dá)質(zhì)粒對細(xì)胞沒有毒害作用。這一工作是通過載體直接在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)小干擾RNA(siRNA)而不是化學(xué)合成的，可以使小干擾RNA在細(xì)胞內(nèi)得到穩(wěn)定表達(dá)，因此本研究設(shè)計的siRNA表達(dá)載體不僅可以有效沉默HCV 5’UTR，而且該系統(tǒng)可以靈敏地篩選更有效的針對HCV的siRNA，因而這一結(jié)果為研究利用RNA干擾進(jìn)行基因治療HCV感染做了初步探索。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
Ⅰ 前言
    1.1 HCV基因組結(jié)構(gòu)及其蛋白功能
    1.2 HCV的生活特性
    1.3 當(dāng)前主要的HCV體外細(xì)胞復(fù)制模型
    1.4 當(dāng)前主要的HCV動物模型
    1.5 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)
    1.6 RNA干擾的分子機(jī)制
    1.7 RNA干擾在抗人類惡性病毒方面的研究進(jìn)展
Ⅱ 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病人血清與細(xì)胞
        2.1.2 質(zhì)粒和菌株
        2.1.3 細(xì)菌與細(xì)胞培養(yǎng)所用溶液
        2.1.4 提取病毒RNA所用的試劑與溶液
        2.1.5 RT反應(yīng)所用試劑
        2.1.6 其他反應(yīng)所用試劑
        2.1.7 PCR產(chǎn)物的回收，克隆，鑒定所用試劑與溶液
        2.1.8 堿裂解法小量提質(zhì)粒試劑
    2.2 方法
        2.2.1 病毒RNA的提取
        2.2.2 RT反應(yīng)
        2.2.3 引物設(shè)計與合成
        2.2.4 PCR反應(yīng)
        2.2.5 PCR或酶切產(chǎn)物的回收
        2.2.6 PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T載體法的連接與轉(zhuǎn)化
        2.2.7 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
        2.2.8 EGFP-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.9 pGL3／CMV與pGL3／CMV-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.10 表達(dá)小干涉RNA載體pSilencer-5’UTR的構(gòu)建
        2.2.11 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.12 DNA的轉(zhuǎn)染
        2.2.13 綠色熒光的觀察與熒光素酶活性的檢測
        2.2.14 細(xì)胞核的染色
Ⅲ 結(jié)果與分析
    3.1 從血清中HCV5’UTR的擴(kuò)增與序列測定
    3.2 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定
    3.3 以HCV 5’UTR為前導(dǎo)序列的報告基因能夠正常表達(dá)
    3.4 針對5’UTR設(shè)計的小干擾RNA能特異性地抑制含有5’UTR的報告基因的表達(dá)
Ⅳ 討論
研究總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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1 畢勝利,白憲鶴,叢勉爾,田厚文,孫得貴,H.S.Margolis,劉崇柏;中國人丙型肝炎病毒基因組的一級結(jié)構(gòu)及其變異[J];病毒學(xué)報;1993年02期

本文編號：2886311