本文關(guān)鍵詞：鼻疽諾卡菌哺乳動物細胞侵襲蛋白生物信息分析及克隆表達與侵襲性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的了解mce基因及蛋白質(zhì)序列的特征,并對其同源性進行分析,構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹,對鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個mce蛋白的二級結(jié)構(gòu)及其B細胞抗原表位進行預(yù)測;從鼻疽諾卡菌IFM10152基因組中擴增6個mce基因(mce1A-mce1F),構(gòu)建6個mce基因的表達載體;誘導(dǎo)表達鼻疽諾卡菌mce1操縱子中的6個mce蛋白,并將誘導(dǎo)成功的蛋白進行純化;將純化后的蛋白進行復(fù)性,并進行侵襲功能的鑒定。方法從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取mce基因及氨基酸序列,利用生物信息軟件Lasergene和MEGA對其進行分析并構(gòu)建進化樹;綜合BepiPred法、可塑性方案、抗原性方案、表面可及性方案、親水性方案以及二級結(jié)構(gòu)對6個mce蛋白進行B細胞抗原表位預(yù)測;采用PCR技術(shù)擴增6個mce基因,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建表達載體;利用IPTG進行誘導(dǎo)表達,超聲裂解后利用SDS-PAGE鑒定其表達形式,將獲得的蛋白利用His Bind蛋白純化試劑盒進行純化,并通過透析法對純化后的蛋白進行復(fù)性;利用乳膠微粒包被復(fù)性后的蛋白,與HeLa細胞共同培養(yǎng),收集細胞后,利用透射電子顯微鏡觀察侵襲結(jié)果。結(jié)果(1)鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個mce基因之間的相似性為40.1%~54.6%,不同菌之間mce蛋白具有一定的同源性;(2)鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個mce蛋白均含有一個跨膜結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)以不規(guī)則卷曲為主,mce1A、mce1D、mce1E蛋白均含有6個B細胞抗原表位mce1B蛋白含有7個B細胞抗原表位,mce1C蛋白含有2個B細胞抗原表位,mce1F蛋白含有10個B細胞抗原表位,且大多位于蛋白質(zhì)C-端;(3)成功擴增了6個mce基因,并構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET30a-mce1A、pET30a-mce1B、pET30a-mce1C、pET30a-mce1D、pET30a-mce1E、pET30a-mce1F,成功誘導(dǎo)表達了mce1A、mce1C、mce1D、mce1E蛋白,其中mce1A、mce1C蛋白的表達量較低,mce1D、mce1E則獲得了大量的表達,各蛋白均以包涵體的形式存在;(4)成功純化了mce1A、mce1D、mce1E蛋白,并對mce1D、mce1E蛋白進行了復(fù)性;(5)經(jīng)乳膠微粒包被后的mce1D、mce1E蛋白侵襲HeLa細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均能進入到HeLa細胞內(nèi)。結(jié)論鼻疽諾卡菌mce1操縱子不同mce蛋白之間及不同菌的mce蛋白之間具有一定的同源性;鼻疽諾卡菌mce蛋白為膜蛋白,大部分結(jié)構(gòu)位于膜外,且具有多個潛在的B細胞抗原表位;鼻疽諾卡菌mce蛋白的誘導(dǎo)表達受基因本身及載體的影響,同時也與IPTG濃度及誘導(dǎo)時間有關(guān);獲得了純化后的蛋白,進行復(fù)性后驗證了mce1D、mce1E蛋白具有侵襲功能。
【關(guān)鍵詞】：鼻疽諾卡菌 生物信息學(xué) 抗原表位 克隆表達 哺乳動物細胞侵襲蛋白
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378;Q811.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 前言12-16
• 第二章 鼻疽諾卡菌哺乳動物細胞侵襲蛋白的生物信息分析16-30
• 1 材料與方法16-17
• 1.1 序列16
• 1.2 在線分析的主要網(wǎng)站16
• 1.3 生物信息分析軟件16
• 1.4 鼻疽諾卡菌mce基因序列與氨基酸序列的獲取及及其分析16
• 1.5 鼻疽諾卡菌mce(1A-1F)蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測16
• 1.6 鼻疽諾卡菌mce(1A-1F)蛋白抗原表位預(yù)測16-17
• 2 結(jié)果17-27
• 2.1 鼻疽諾卡菌mce1操縱子各mce基因序列的同源性分析結(jié)果17-18
• 2.2 Mce蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析18-19
• 2.3 鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個mce蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果19-21
• 2.4 鼻疽諾卡菌mce1操縱子6個mce蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測21-22
• 2.5 鼻疽諾卡菌mce1操縱子各蛋白的抗原表位預(yù)測22-27
• 3 討論27-30
• 第三章 鼻疽諾卡菌mce1操縱子哺乳動物細胞侵襲蛋白的克隆表達及純化30-54
• 1 實驗材料和方法30-43
• 1.1 材料和試劑30-33
• 1.2 主要溶液及培養(yǎng)基的配制33-36
• 1.3 實驗方法36-43
• 2 結(jié)果43-50
• 2.1 mce基因PCR擴增43
• 2.2 重組質(zhì)粒的鑒定43-44
• 2.3 mce重組蛋白誘導(dǎo)結(jié)果44-47
• 2.4 鼻疽諾卡菌mce1操縱子mce重組蛋白表達形式的鑒定及純化結(jié)果47-49
• 2.5 重組蛋白mce1D、mce1E的復(fù)性49
• 2.6 重組蛋白濃度的測定49-50
• 3 討論50-54
• 第四章 鼻疽諾卡菌哺乳動物細胞侵襲蛋白mce1D及mce1E侵襲功能的研究54-60
• 1 材料與方法54-57
• 1.1 材料與試劑54
• 1.2 主要溶液的配制54-55
• 1.3 實驗方法55-57
• 2 結(jié)果57-58
• 3 討論58-60
• 第五章 結(jié)論與展望60-61
• 參考文獻61-65
• 綜述 哺乳動物侵襲蛋白研究進展65-73
• 參考文獻69-73
• 附錄73-79
• 作者攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文79-80
• 中英文縮略對照表80-81
• 致謝81

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1 李軍,席麗艷,魯長明;鼻疽諾卡菌基因組DNA及細胞脂肪酸組成分析[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2004年05期

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1 譚曉羅;鼻疽諾卡菌哺乳動物細胞侵襲蛋白生物信息分析及克隆表達與侵襲性研究[D];南華大學(xué);2016年

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本文編號：288284