柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是小核糖核酸病毒科腸道病毒屬病毒,是手足口病(Hand,foot and mouse disease,HFMD)的主要病原體之一。CV-A16在世界范圍內(nèi)廣泛流行,但目前還沒有有效預(yù)防CV-A16感染的疫苗上市,CV-A16疫苗的研發(fā)仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本研究從改善CV-A16誘導(dǎo)體液免疫能力的角度出發(fā),利用反向遺傳學(xué)手段構(gòu)建共表達(dá)趨化因子配體13的重組A組16型柯薩奇病毒(Coxsackievirus A16-Chemokine(C-X-C motif)ligand 13,CV-A16-CXCL13)。首先利用全基因合成方法設(shè)計(jì)合成MluⅠ-T7-5'UTR-CXCL13-VP4-VP2-NdeⅠ片段,將該片段插入pCR-XL-TOPO-CV-A16載體中,獲得pCR-XL-TOPO-CV-A16-CXCL13克隆載體。將該載體線性化,體外轉(zhuǎn)錄出重組病毒RNA并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,最終獲得包裝成功的CV-A16-CXCL13重組病毒。使用PCR檢測(cè)到病毒感染細(xì)胞后趨化因子配體13(Chemokine (C-X-C motif) ligand 13,CXCL13)及結(jié)構(gòu)蛋白VP1在基因水平的表達(dá);免疫印記及免疫熒光結(jié)果檢測(cè)到(CXCL13與VP1蛋白水平的表達(dá);電鏡結(jié)果顯示重組病毒為直徑20～30nm球狀顆粒;增殖曲線顯示重組病毒能夠在細(xì)胞中正常復(fù)制。本研究成功構(gòu)建了CV-A16-CXCL13病毒,為CV-A16感染特征的研究和疫苗研發(fā)提供參考。
【文章目錄】：
材料與方法
    1 病毒株、細(xì)胞株、載體
    2 主要試劑
    3 序列及引物合成
    4 載體的構(gòu)建
    5 病毒的拯救及鑒定
    6 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)
    7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    8 透射式電子顯微鏡
    9 實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄定量PCR
    1 0 病毒TCID50測(cè)定
結(jié)果
    1pCR-XL-TOPO-CV-A16-CXCL13載體的鑒定
    2 CV-A16-CXCL13病毒的鑒定
    3 CV-A16-CXCL13病毒顆粒的形態(tài)觀察
    4 CV-A16-CXCL13病毒的增殖動(dòng)力學(xué)分析
討論

【參考文獻(xiàn)】
【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2880105