目的建立造血干細(xì)胞特異性Hdac3條件性敲除小鼠模型,探討Hdac3基因?qū)π∈笤煅l(fā)育的影響。方法 Hdac3~(fl/fl)小鼠與Mx1-Cre小鼠雜交獲得Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre小鼠,PCR鑒定小鼠基因型。連續(xù)注射poly(I:C),誘導(dǎo)Cre表達(dá),得到造血干細(xì)胞Hdac3敲除鼠Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre~+(CKO)及對(duì)照組小鼠Hdac3~(+/+)Mx1-Cre~+(WT),Q-PCR分析Hdac3 mRNA表達(dá)水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量及比例。HE染色觀察小鼠胸腺、脾臟形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血CD3~+、B220~+細(xì)胞比例�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)分析小鼠造血干/祖(LSK)細(xì)胞的分化能力。結(jié)果成功建立造血干細(xì)胞Hdac3~(fl/fl)Mx1-Cre~+(CKO)小鼠模型。與對(duì)照組相比,CKO小鼠外周血淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量(P0.001)及比例(P0.01)均顯著降低;細(xì)胞亞群分析顯示,CKO小鼠外周血CD3~+淋巴細(xì)胞及B220~+淋巴細(xì)胞顯著減少(P0.01,P0.001),CD11b~+髓系細(xì)胞比例顯著增加(P0.01)。HE染色結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組鼠胸腺和脾淋巴細(xì)胞數(shù)減少。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,實(shí)驗(yàn)組小鼠粒系克隆數(shù)無差異,前B細(xì)胞樣克隆缺失。結(jié)論造血干細(xì)胞中Hdac3基因促進(jìn)造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化。
【部分圖文】：

1-Cre+(CKO)小鼠(圖1B)。處死小鼠后，通過TqPCＲ分析WT對(duì)照組及CKO小鼠骨髓LSK細(xì)胞Hdac3表達(dá)。與對(duì)照組相比，CKO小鼠Hdac3的mＲNA表達(dá)水平顯著降低［(1．000±0．203)vs(0．048±0．025)，P＜0．01］。結(jié)果顯示，成功建立了造血干細(xì)胞CKO小鼠模型。A:Hdac3條件性敲除小鼠模型構(gòu)建示意圖;B:poly(I:C)誘導(dǎo)Cre表達(dá)示意圖;C:小鼠基因型鑒定PCＲ結(jié)果左側(cè)圖示PCＲ擴(kuò)增小鼠Hdac3基因，Hdac3fl/fl小鼠產(chǎn)物大小約330bp、Hdac3+/+小鼠產(chǎn)物大小約280bp，小于250bp產(chǎn)物為內(nèi)參;右側(cè)圖示PCＲ擴(kuò)增小鼠Mx1-Cre基因，產(chǎn)物大小約272bp;M:標(biāo)準(zhǔn)圖1成功建立造血干細(xì)胞Hdac3-CKO小鼠模型648第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41(9)http://aammt．tmmu．edu．cn

，兩組間血小板、紅細(xì)胞、血紅蛋白數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但CKO小鼠外周血白細(xì)胞明顯低于對(duì)照組(P＜0．01)，其中以淋巴細(xì)胞數(shù)減少為主(P＜0．001)，而中性粒細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，圖2A、B)。通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞分群顯示，CKO小鼠外周血淋巴細(xì)胞群比例明顯低于對(duì)照組［(14．764±3．612)%vs(28．800±2．884)%，P＜0．01，圖2C］。為進(jìn)一步明確Hdac3敲除對(duì)小鼠造血發(fā)育影響，利用流式細(xì)胞術(shù)和CD3、B220及CD11b標(biāo)記，檢測(cè)小鼠外周血中T細(xì)胞、B細(xì)胞及粒細(xì)胞各群比例，結(jié)果顯示，與WT組比較，CKO小鼠中T/B淋巴細(xì)胞比例顯著降低［(28．500±2．179)%vs(16．700±1．836)%，P＜0．01;(29．933±2．610)%vs(10．047±1．631)%，P＜0．001］，粒細(xì)胞比例顯著升高［(25．567±2．108)%vs(43．533±4．500)%，P＜0．01，圖2D～F］。結(jié)果顯示，CKO小鼠中淋巴細(xì)胞發(fā)育受阻，但對(duì)粒/單核細(xì)胞群發(fā)育無影響。2．3Hdac3fl/flMx1-Cre+小鼠胸腺及脾淋巴細(xì)胞生成障礙為進(jìn)一步檢測(cè)Hdac3敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)影響，取小鼠造血器官做組織學(xué)形態(tài)觀察。大體形態(tài)學(xué)觀察顯示CKO小鼠胸腺和脾體積明顯變小(圖3)。HE染色結(jié)果顯示，CKO小鼠胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)目顯著少于WT鼠(圖4A)，CKO小鼠脾內(nèi)淋巴細(xì)胞生發(fā)中心數(shù)顯著少于WT鼠(圖4B)。為探究外周血淋巴細(xì)胞減少原因，A:CKO及WT小鼠外周血血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞(ＲBC)、血小板(PLT)絕對(duì)計(jì)數(shù);B:CKO?

檢測(cè)了胸腺細(xì)胞發(fā)育至T細(xì)胞各期細(xì)胞比例，明確T細(xì)胞減少是否由T細(xì)胞胸腺內(nèi)發(fā)育阻滯引起。根據(jù)胸腺細(xì)胞表面CD4、CD8表達(dá)，胸腺細(xì)胞分為DN(CD4－CD8－)、CD4單陽(SP:CD4+CD8－)、CD8單陽(SP:CD4－CD8+)及DP(CD4+CD8+)期，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示兩組間胸腺細(xì)胞DN、SP、DP期胸腺細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4C)。進(jìn)一步根據(jù)CD4－CD8－胸腺細(xì)胞表面CD44、CD25的表達(dá)，將DN期分為DN1(CD44+CD25－)、DN2(CD44+CD25+)、DN3(CD44－CD25+)和DN4(CD44－CD25－)期，流式細(xì)胞分析顯示兩組間DN1～4期胸腺細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，圖4D)。結(jié)果顯示CKO鼠的胸腺及脾臟發(fā)生淋巴細(xì)胞生成障礙，其可能是由造血干細(xì)胞分化至淋巴祖細(xì)胞障礙引起。圖3WT及CKO小鼠胸腺、脾臟大體形態(tài)A、B:HE染色后光鏡下觀察WT及CKO小鼠胸腺、脾臟組織形態(tài)學(xué)變化;C:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT及CKO小鼠胸腺細(xì)胞CD4及CD8表達(dá)情況;右側(cè)柱狀圖表示DN、CD4單陽、CD8單陽及DP胸腺細(xì)胞比例;D:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)WT及CKO小鼠CD4－CD8－胸腺細(xì)胞CD44及CD25表達(dá)情況;右側(cè)柱狀圖表示DN1、DN2、DN3及DN4各期胸腺細(xì)胞的比例圖4Hdac3fl/flMx1-Cre+小鼠胸腺及脾臟淋巴細(xì)胞生成障礙848第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41(9)http://aammt．tmmu．edu．cn
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