目的:研究表達ESAT-6-Ag85A(ES85A)融合基因的侵入型乳酸菌對小鼠體內免疫特性的影響。方法:將真核表達載體p Valac與ES85A連接構建真核表達質粒,并將其分別電轉到重組乳酸菌NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA感受態(tài)中,構建雙質粒的乳酸菌p Valac-ES85A/409和p Valac-ES85A/Fn BPA。將其免疫BALB/c小鼠,檢測表達ES85A的侵入型乳酸菌對小鼠樹突狀細胞(DCs)亞群CD80和CD83的影響以及血清中細胞因子的表達水平。結果:Western blot和免疫熒光證明ES85A蛋白成功表達;與空載體組相比,在小鼠免疫表達ES85A的侵入型乳酸菌后,小鼠脾細胞中CD11~+CD80~+(P0. 001)和CD11~+CD83~+(P0. 01)以及血清中細胞因子IL-4(P0. 05)的表達都有所增加。結論:表達ES85A的侵入型乳酸菌能促進小鼠體內DCs的分化和成熟以及提高血清中細胞因子IL-4的表達,為后期研制抗結核分枝桿菌的DNA疫苗制劑奠定了基礎。
【部分圖文】：

93T細胞48h后的細胞沉淀進行檢測，可見在53kD處出現(xiàn)清晰可見的蛋白條帶，而陰性對照中未見到任何的蛋白條帶，如圖2。2.3間接免疫熒光檢測結果將構建好的真核質粒pValac-ES85A轉染293T細胞，48h后使用間接免疫熒光標記目標蛋白，使用共聚焦顯微鏡觀察(×400)，如圖3A所示，轉染空載體pValac質粒的細胞中，沒有任何的蛋白表達;轉染pValac-ES85A質粒的細胞中可以看出蛋白ES85A的大量表達(圖3B);圖3C中是轉染陽性質粒pValac-gfp，可見有大量的gfp表達。圖1ES85A和pValac的酶切片段及重組質粒酶切鑒定Fig．1IdentificationofES85AandpValacbydoubledi-gestionaswellasrecombinantplasmidbydoubledigestionNote:Fig.A.1.ProductofpValacvector(KpnⅠ/XbaⅠ)bydoubledigestion;2.ProductofES85Agene(KpnⅠ/XbaⅠ)bydoubledigestion;Fig.B.1.IdentificationofpValac-ES85Abydoubledi-gestion;M.DL5000marker.·21·中國免疫學雜志2019年第35卷

圖2Westernblot檢測ES85A融合蛋白在293T細胞中的表達Fig．2ExpressionofES85Afusionproteinin293TcellsbyWesternblotNote:M.Lowmolecularweightproteinmarker;1.ExpressionofcontrolvectorpValacin293Tcells;2.ExpressionofpValac-ES85Ain293Tcells.圖3共聚焦顯微鏡觀察轉染293T細胞48h后ES85A蛋白的表達Fig．3ExpressionofES85Aproteinaftertransfection293Tcells48hwasobservedbyconfocalmicro-scopeNote:A.Negativecontrol:pValac;B.PlasmidpValac-ES85Aoftrans-fection;C.Positivecontrol:pValac-gfp.Cellnucleuswaslabeledusingblueandexpressingproteinorgfpwerelabeledbygreen.Theblueandgreenweremergedinthepictures.2.4流式細胞術檢測表達ES85A的侵入型乳酸菌對小鼠DCs亞群的影響使用流式抗體CD11c、CD80和CD83標記處理好的脾細胞，使用流式細胞儀進行檢測，檢測結果如圖4所示，可見與空載體組相比，表達ES85A蛋白的重組乳酸菌組更能促進小鼠脾細胞中CD11+CD80+(P＜0.001)和CD11+CD83+(P＜0.01)的表達，進而促進樹突細胞的分化和成熟。2.5ELISA檢測結果收集免疫后第42天的小鼠血清，使用ELISA檢測小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-4的表達情況。結果顯示與空載體組相比，表達ES85A的重組乳酸菌中IL-4的含量顯著升高，尤其是表達ES85A的侵入型乳酸菌的效果更顯著(P＜0.05)，但IFN-γ含量各組之間沒有顯著的差異，如圖5。3討論乳酸菌屬于益生菌，可以作為DNA疫苗的遞送載體，但其遞送效率不高［11］，為了提高遞送效率，我圖4?

圖2Westernblot檢測ES85A融合蛋白在293T細胞中的表達Fig．2ExpressionofES85Afusionproteinin293TcellsbyWesternblotNote:M.Lowmolecularweightproteinmarker;1.ExpressionofcontrolvectorpValacin293Tcells;2.ExpressionofpValac-ES85Ain293Tcells.圖3共聚焦顯微鏡觀察轉染293T細胞48h后ES85A蛋白的表達Fig．3ExpressionofES85Aproteinaftertransfection293Tcells48hwasobservedbyconfocalmicro-scopeNote:A.Negativecontrol:pValac;B.PlasmidpValac-ES85Aoftrans-fection;C.Positivecontrol:pValac-gfp.Cellnucleuswaslabeledusingblueandexpressingproteinorgfpwerelabeledbygreen.Theblueandgreenweremergedinthepictures.2.4流式細胞術檢測表達ES85A的侵入型乳酸菌對小鼠DCs亞群的影響使用流式抗體CD11c、CD80和CD83標記處理好的脾細胞，使用流式細胞儀進行檢測，檢測結果如圖4所示，可見與空載體組相比，表達ES85A蛋白的重組乳酸菌組更能促進小鼠脾細胞中CD11+CD80+(P＜0.001)和CD11+CD83+(P＜0.01)的表達，進而促進樹突細胞的分化和成熟。2.5ELISA檢測結果收集免疫后第42天的小鼠血清，使用ELISA檢測小鼠血清中細胞因子IFN-γ和IL-4的表達情況。結果顯示與空載體組相比，表達ES85A的重組乳酸菌中IL-4的含量顯著升高，尤其是表達ES85A的侵入型乳酸菌的效果更顯著(P＜0.05)，但IFN-γ含量各組之間沒有顯著的差異，如圖5。3討論乳酸菌屬于益生菌，可以作為DNA疫苗的遞送載體，但其遞送效率不高［11］，為了提高遞送效率，我圖4?
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