背景：由于神經(jīng)干細胞能夠自我復(fù)制并能產(chǎn)生各種類型的神經(jīng)細胞，它將在神經(jīng)系統(tǒng)疾病進行細胞治療中發(fā)揮重要的作用。然而目前神經(jīng)干細胞在體外的擴增極其有限，這給它在研究和臨床應(yīng)用方面帶來極大的不便。通過轉(zhuǎn)端粒酶建立永生神經(jīng)干細胞系是解決該問題的一個很好的方法，但轉(zhuǎn)端粒酶是否會使神經(jīng)干細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化則是人們擔(dān)心的另一個問題。而bFGF對神經(jīng)干細胞的增殖和分化有著重要的作用，然而它如何實現(xiàn)這兩種不同作用是值得深入去研究的。 目的：鑒定實驗室建立的轉(zhuǎn)端粒酶永生化神經(jīng)干細胞系(HNG和HNG-E)。研究bFGF在神經(jīng)干細胞中的增殖和分化作用。 方法：通過成瘤實驗、流式細胞術(shù)分析、Fluo-3鈣內(nèi)流實驗、基因芯片、細胞免疫熒光技術(shù)、RT-PCR和Western blot等方法對HNG和HNG-E細胞進行鑒定；通過將重組bFGF表達載體(包括pRevTRE／IgK-bFGF和pcDNA3.1(-)／bFGF)轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細胞和HNG-E細胞中，并用細胞免疫熒光技術(shù)和Western blot對其進行鑒定。 結(jié)果：HNG細胞表達外源端粒酶，同時不具有致瘤性。它為CD90陽性細胞，并能共表達Nestin和GFAP，經(jīng)RA誘導(dǎo)后可表達MAP2和01(oligophrenin-1)。HNG—E細胞來自早期HNG細胞，具有致瘤性，并失去HNG細胞的原有的表型，但能在RA誘導(dǎo)下表達多巴胺受體2。轉(zhuǎn)入bFGF表達載體到神經(jīng)干細胞后，細胞沒有增殖而發(fā)生分化。轉(zhuǎn)入bFGF表達載體到HNG-E細胞建立HNG-E＼bFGF。HNG-E＼bFGF表達外源bFGF，并表達GFAP。 暨南大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘 要 結(jié)論：經(jīng)鑒定，證實HNG細胞為具有神經(jīng)干細胞表型的永生化細胞系。而HNG－E則為發(fā)生 轉(zhuǎn)化的神經(jīng)干細胞系，但能在RA誘導(dǎo)下向多巴胺能神經(jīng)元分化。bFGF轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細胞后 能促使其向神經(jīng)元方向分化。而bFGF對HNG－E細胞具有雙向功能，一方面在培養(yǎng)基中加 入bFGF能夠促進HNG－E細胞的增殖，另一方面將外源bFGF轉(zhuǎn)入HNG－E細胞中表達又能夠 使其表型發(fā)生變化具有神經(jīng)干細胞的表型。
【學(xué)位單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

圖1.端粒結(jié)構(gòu)示意圖2.3端粒酶(Telomerase)人端粒酶是一種核糖核蛋白酶，包括了兩個主要的亞基:1.RNA組分(hTERC)，它多聚酶反應(yīng)的模板;2.具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的催化亞單位(hTERT)。體外實驗證實了，存在hTERc和hTERT就足以重建端粒酶的活性�！�41j而許多研究表明外源性hTERT的表足以恢復(fù)端粒酶陰性細胞中端粒酶的活性。仁42一44j端粒酶能以自身的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)成人類端粒DNA重復(fù)序列TTAGGG并添加于染色體3’末端，從而阻止了每次細胞分裂粒序列的丟失，維持了染色體長度的穩(wěn)定(端粒酶延長端粒見圖2)。端粒酶在生物體內(nèi)的表達受到多種蛋白質(zhì)反式作用的調(diào)控。如p53蛋白可能通過定端粒的T一環(huán)上而降低了TERT基因的轉(zhuǎn)錄，而HPV16E6的基因產(chǎn)物則能增加該基因的轉(zhuǎn)�！�35，‘5，‘6〕近期的研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶在體內(nèi)表達受到C一MYc的直接調(diào)控。由于在TERT啟動有許多C一MYC結(jié)合位點，這些位點與TERT的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。因此CesesMYC所誘導(dǎo)的TERT的表達行TE因�！仓菀话紫喽绊�

圖2.端粒酶延長端粒示意圖端粒長度與細胞衰老和永生化的假說前關(guān)于端粒長度與細胞死亡期的關(guān)系存在一些假說。〔49j在正常的來自多種組性的非永生化細胞中，存在至少兩個端粒依賴的致死期。第一個致死期又稱被認為是由于檢查點的捕獲所致。它可能是通過因關(guān)鍵端粒的缺失或者是一體末端的去帽作用而引起的DNA損傷反應(yīng)所致。如果細胞缺失這個檢查點或長控制突變，細胞就會通過第一死亡期而繼續(xù)分裂，使端粒DNA不斷減少，期(或稱危機期)為止。(見圖3)危機期的表征是1.主要端粒失去功能2，3.出現(xiàn)細胞凋亡。

圖2.端粒酶延長端粒示意圖.2.4端粒長度與細胞衰老和永生化的假說目前關(guān)于端粒長度與細胞死亡期的關(guān)系存在一些假說�！�49j在正常的來自多種組織的酶陰性的非永生化細胞中，存在至少兩個端粒依賴的致死期。第一個致死期又稱復(fù)制老，被認為是由于檢查點的捕獲所致。它可能是通過因關(guān)鍵端粒的缺失或者是一個或染色體末端的去帽作用而引起的DNA損傷反應(yīng)所致。如果細胞缺失這個檢查點或是發(fā)化生長控制突變，細胞就會通過第一死亡期而繼續(xù)分裂，使端粒DNA不斷減少，直至致死期(或稱危機期)為止。(見圖3)危機期的表征是1.主要端粒失去功能2，遺穩(wěn)定3.出現(xiàn)細胞凋亡。
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本文編號：2872215