目的利用雙重sgRNAs構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠。方法針對miR-223基因設(shè)計(jì)雙重sgRNAs,將體外轉(zhuǎn)錄的sgRNAs和Cas9 mRNA共同顯微注射入C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞。小鼠出生后取其基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序以鑒定基因型,同時(shí)取小鼠肝臟研磨后提取總RNA,通過real-time PCR分析miR-223在肝臟中的表達(dá)。結(jié)果設(shè)計(jì)了miR-223基因雙重sgRNAs并對其進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄,純化后顯微注射小鼠受精卵細(xì)胞獲得miR-223基因突變小鼠。測序結(jié)果表明突變小鼠有3種基因型,一種為6 bp的缺失突變,但未對miR-223序列產(chǎn)生影響;另外兩種為162 bp和168 bp的缺失突變,完全刪除miR-223前體和成熟區(qū)序列。與野生型相比,這兩種小鼠肝組織中幾乎不能檢測到miR-223的表達(dá)。結(jié)論設(shè)計(jì)雙重sgRNAs并應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建miR-223全基因敲除小鼠。
【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)動物
    1.2 主要試劑
    1.3 實(shí)驗(yàn)方法
        1.3.1 雙重sgRNAs設(shè)計(jì)和轉(zhuǎn)錄
        1.3.2 sgRNA體外切割效率
        1.3.3 顯微注射及受精卵細(xì)胞移植
        1.3.4 敲除小鼠基因型鑒定
        1.3.5 Real time PCR鑒定miR-223在敲除小鼠體內(nèi)的表達(dá)
2 結(jié)果
    2.1 雙重sgRNAs轉(zhuǎn)錄
    2.2 miR-223敲除小鼠基因型鑒定
    2.3 miR-223在敲除小鼠體內(nèi)表達(dá)
3 討論

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2872206