β-防御素是數(shù)十個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子小肽，具有廣譜抗微生物活性，在先天性與獲得性免疫中具有一定的作用。β-防御素-2在呼吸道上皮和漿液細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)誘導(dǎo)性表達(dá)，β-防御素-2的缺乏將引起肺囊性纖維化和感染，β-防御素-2肽可能是一種在抗感染和腫瘤免疫調(diào)節(jié)方面中具有重要作用的新型藥物。 目前，從皮膚等上皮組織中提取得到的β-防御素-2多肽的量非常有限，而采用化學(xué)合成法得到β-防御素-2多肽的成本較大、三級(jí)結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性與天然的β-防御素-2多肽相差大，而基因工程用于小肽的生產(chǎn)已有十余年的歷史，因此，我們嘗試采用基因工程的方式來(lái)獲得目標(biāo)產(chǎn)物。但是，基因工程生產(chǎn)β-防御素-2肽技術(shù)方法尚未成熟。大腸桿菌由于其生長(zhǎng)迅速且有良好的表達(dá)系統(tǒng)而被廣泛地用作基因工程的宿主菌。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)β-防御素2有一定的問(wèn)題存在：其一是由于β-防御素-2抗革蘭氏陰性菌的作用，可能對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒性作用從而破壞了整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)。此外，外源蛋白在宿主菌中可能被宿主菌蛋白酶水解。針對(duì)上述兩點(diǎn)，我們通過(guò)表達(dá)融合蛋白來(lái)避免β-防御素2的殺傷宿主菌的作用、 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 選擇蛋白水解活力相對(duì)較低的大腸桿菌菌株來(lái)減少外源蛋白的破壞，此外，我們 將菌株生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)分成不同的階段，盡量避免以上的不利條件。 研究目的 利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建大鼠p一防御素一2原核表達(dá)質(zhì)粒pET32一rBDZ，研究 重組子在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)，為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)D一防御素一2多膚、 及p一防御素一2多膚的生物學(xué)活性等的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法 取健康SD清潔型大鼠的肺組織;提取組織總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄方法獲取CDNA， 用PCR方法從cDNA中獲取目的基因(rBD一2)片段;目的基因rBD一2和載體質(zhì)粒 pET一32純化后，分別用Ncoll和Hindm進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行連接;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化感受態(tài)大腸桿菌DHSQ，陽(yáng)性重組子經(jīng)PCR擴(kuò)增、雙酶切和測(cè)序鑒定確定為目 標(biāo)質(zhì)粒pET一32一rBDZ。陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，培養(yǎng)發(fā)酵 pET32--rBDZ一BL21(DE3)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG誘導(dǎo)其外源蛋白的表達(dá)，以 western Blotting方法明確原核表達(dá)產(chǎn)物的性質(zhì)。 結(jié)果 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 RT一PCR方法從大鼠肺組織中獲取了大小為1 52bp的基因擴(kuò)增產(chǎn)物: 2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物成功地接入載體質(zhì)粒pET一32，經(jīng)測(cè)序顯示重組子基因序列及插入 方向正確，未出現(xiàn)移碼和錯(cuò)碼; 3.重組子轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，37℃條件下培養(yǎng)經(jīng)IpTG誘導(dǎo)rBD一2的 融合蛋白在大腸桿菌中能得到表達(dá)，可溶部分目的蛋白量占了目的蛋白絕大部 分，為88.9%，目的蛋白量在整個(gè)可溶部分占的比例為62.4%，western blot驗(yàn) 證了表達(dá)產(chǎn)物為rBd一2的融合蛋白。 結(jié)論 大鼠p一防御素一2(rBD一2)能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得 到表達(dá)，為大規(guī)模生產(chǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其他抗微生物膚的表達(dá)、生產(chǎn)提供 了一定的借鑒。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
正文
    前言
    材料 方法 結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述
致謝
附錄

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2868888