固有免疫系統(tǒng)作為宿主第一道防線,對(duì)侵入的病原體能夠迅速應(yīng)答,產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用。在病原體感染過(guò)程中,參與固有免疫的宿主細(xì)胞可通過(guò)其自身的模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),進(jìn)而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、Ⅰ型干擾素、趨化因子等發(fā)揮天然免疫防御功能,并啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答。其中研究比較深入的PRRs是膜結(jié)合型的Toll樣受體(Toll-like receptors.TLRs)。機(jī)體在應(yīng)激或損傷時(shí)可同時(shí)釋放危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(Damage-Associated Molecular Pattern,DAMP),通過(guò)激活相應(yīng)的受體發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。其中一類重要的危險(xiǎn)信號(hào)分子是胞外核苷酸,這類分子能夠與其相應(yīng)的嘌呤類受體相結(jié)合而引起下游信號(hào)的激活來(lái)誘導(dǎo)并調(diào)控免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),外源性UDP可以誘導(dǎo)體內(nèi)巨噬細(xì)胞釋放MCP-1,招募單核細(xì)胞進(jìn)入細(xì)菌感染部位,從而發(fā)揮抗菌保護(hù)作用。但目前對(duì)于在細(xì)菌感染過(guò)程中內(nèi)源性UDP的來(lái)源、釋放機(jī)制以及其與TLRs的相互調(diào)控機(jī)制還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)導(dǎo)。本論文以巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過(guò)模擬細(xì)菌感染過(guò)程,發(fā)現(xiàn)TLR信號(hào)通路的激活會(huì)增加ERK的磷酸化水平,上調(diào)Cx43的表達(dá),促進(jìn)UDP的釋放,UDP作用相應(yīng)的P2Y6受體,引起MCP-1的釋放,從而招募更多的單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而提高機(jī)體抵抗細(xì)菌的能力。論文包括如下幾個(gè)方面：1.細(xì)菌感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞釋放UDP本論文通過(guò)腹腔注射E.coli 0111大腸桿菌的方法建立小鼠腹膜炎感染模型,并通過(guò)熒光偏振技術(shù)對(duì)小鼠腹腔中釋放的UDP進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果顯示在細(xì)菌感染過(guò)程中,隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠腹腔液中的UDP釋放量明顯增多,表明細(xì)菌感染可以誘導(dǎo)機(jī)體釋放UDP。同時(shí)本文以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型,采用革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌模式分子Pam3CSK4和LPS刺激巨噬細(xì)胞來(lái)模擬細(xì)菌感染過(guò)程。結(jié)果顯示,Pam3CSK4和LPS 可以刺激巨噬細(xì)胞釋放UDP,并呈現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴的釋放方式。研究結(jié)果表明細(xì)菌感染與UDP的釋放具有相關(guān)性,而且UDP的釋放過(guò)程可能與TLR的激活有一定的聯(lián)系。2.Connexin43通道介導(dǎo)UDP的釋放根據(jù)目前的研究報(bào)道,胞外核苷酸的釋放與通道蛋白、胞吐作用有關(guān),因此,本研究應(yīng)用膜通道釋放抑制劑CBX、FFA以及胞吐抑制劑NEM預(yù)處理細(xì)胞后,檢測(cè)這些抑制劑對(duì)UDP釋放的影響。結(jié)果顯示,胞吐抑制劑NEM對(duì)細(xì)胞釋放UDP的過(guò)程沒(méi)有影響,而膜通道釋放抑制劑CBX和FFA均可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的UDP釋放,其中Connexin通道抑制劑FFA抑制效果最為明顯。進(jìn)一步采用RT-PCR的方法,顯示Connexin43 (Cx43)是巨噬細(xì)胞主要表達(dá)的連接蛋白,熒光定量PCR以及Western blot方法均證實(shí)LPS刺激可以增加Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過(guò)Western blot方法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)LPS能夠提高ERK、AKT以及P-65的磷酸化水平。分別應(yīng)用ERK、AKT、P-65磷酸化抑制劑U0126、Ly294002、BAY11后,采用熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)U0126能夠明顯抑制Cx43的表達(dá),而Ly294002和BAY11磷酸化抑制劑沒(méi)有明顯的效果。同時(shí),使用Cx43特異性功能抑制劑Gap26以及ERK磷酸化抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞,并通過(guò)熒光偏振技術(shù)檢測(cè)UDP含量,發(fā)現(xiàn)二者均能降低UDP的釋放。結(jié)果表明,LPS通過(guò)ERK信號(hào)通路上調(diào)Cx43的表達(dá),并通過(guò)Cx43通道的打開(kāi)釋放UDP至細(xì)胞外。3.UDP通過(guò)P2Y6受體促進(jìn)MCP-1的釋放從而增加機(jī)體抗菌能力UDP的特異性受體為嘌呤類受體P2Y6,本文采用UDP特異性受體P2Y6抑制劑MRS2578,并同時(shí)構(gòu)建P2Y6敲除小鼠來(lái)檢測(cè)P2Y6對(duì)MCP-1表達(dá)的影響。同時(shí)應(yīng)用U0126與Gap26抑制Cx43的表達(dá)與功能,結(jié)果顯示抑制或缺失P2Y6能夠降低由LPS引起的MCP-1的表達(dá),抑制Cx43的表達(dá)與功能也能夠降低LPS誘導(dǎo)的MCP-1的表達(dá)。表明LPS引起的UDP釋放是通過(guò)促進(jìn)MCP-1的表達(dá),招募更多單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而增加機(jī)體的抗菌能力。在小鼠腹膜炎模型中,細(xì)菌感染前先注射UDP特異性受體抑制劑MRS2578以及UDP釋放抑制劑FFA、U0126、Gap26,均會(huì)降低小鼠體內(nèi)清除細(xì)菌的能力,加速小鼠的死亡。這些結(jié)果表明,在細(xì)菌感染過(guò)程中,釋放的UDP對(duì)于提高小鼠抵抗細(xì)菌感染的能力具有十分重要的作用。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌感染過(guò)程中,由于TLR信號(hào)通路的激活會(huì)引起ERK磷酸化增加,并顯著提高Conenxin43的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)UDP的胞外釋放,胞外釋放的UDP通過(guò)自分泌和旁分泌的方式激活其特異性受體P2Y6,誘導(dǎo)細(xì)胞中MCP-1的表達(dá)和釋放,招募更多單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而提高機(jī)體抗菌能力。本研究從危險(xiǎn)信號(hào)釋放的角度對(duì)機(jī)體抗菌機(jī)制進(jìn)行深入地研究,明確了胞外UDP及其受體在細(xì)菌感染中的重要調(diào)控作用,將固有免疫中的病原體模式識(shí)別與危險(xiǎn)信號(hào)模式識(shí)別機(jī)制有機(jī)地聯(lián)系起來(lái),為深入了解機(jī)體的自我免疫調(diào)控機(jī)制抵抗細(xì)菌感染過(guò)程奠定了理論基礎(chǔ),也為有關(guān)胞外核苷酸的抗菌藥物的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 TLR的激活引起胞外UDP釋放的增加
    一、引言
    二、材料與方法
    三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
第二章 細(xì)菌感染過(guò)程中UDP釋放機(jī)制的研究
    一、引言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
第三章 胞外UDP釋放的抗菌功能研究
    一、引言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
全文總結(jié)
附錄一
    TABLEⅠ名次縮略
    TABLEⅡ
附錄二
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝

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本文編號(hào)：2865148