固有免疫系統(tǒng)作為宿主第一道防線,對侵入的病原體能夠迅速應(yīng)答,產(chǎn)生非特異抗感染免疫作用。在病原體感染過程中,參與固有免疫的宿主細(xì)胞可通過其自身的模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),進(jìn)而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子、Ⅰ型干擾素、趨化因子等發(fā)揮天然免疫防御功能,并啟動獲得性免疫應(yīng)答。其中研究比較深入的PRRs是膜結(jié)合型的Toll樣受體(Toll-like receptors.TLRs)。機體在應(yīng)激或損傷時可同時釋放危險相關(guān)分子模式(Damage-Associated Molecular Pattern,DAMP),通過激活相應(yīng)的受體發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。其中一類重要的危險信號分子是胞外核苷酸,這類分子能夠與其相應(yīng)的嘌呤類受體相結(jié)合而引起下游信號的激活來誘導(dǎo)并調(diào)控免疫反應(yīng)。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),外源性UDP可以誘導(dǎo)體內(nèi)巨噬細(xì)胞釋放MCP-1,招募單核細(xì)胞進(jìn)入細(xì)菌感染部位,從而發(fā)揮抗菌保護(hù)作用。但目前對于在細(xì)菌感染過程中內(nèi)源性UDP的來源、釋放機制以及其與TLRs的相互調(diào)控機制還未見詳細(xì)報導(dǎo)。本論文以巨噬細(xì)胞作為研究對象,通過模擬細(xì)菌感染過程,發(fā)現(xiàn)TLR信號通路的激活會增加ERK的磷酸化水平,上調(diào)Cx43的表達(dá),促進(jìn)UDP的釋放,UDP作用相應(yīng)的P2Y6受體,引起MCP-1的釋放,從而招募更多的單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而提高機體抵抗細(xì)菌的能力。論文包括如下幾個方面：1.細(xì)菌感染可以誘導(dǎo)細(xì)胞釋放UDP本論文通過腹腔注射E.coli 0111大腸桿菌的方法建立小鼠腹膜炎感染模型,并通過熒光偏振技術(shù)對小鼠腹腔中釋放的UDP進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示在細(xì)菌感染過程中,隨著感染時間的延長,小鼠腹腔液中的UDP釋放量明顯增多,表明細(xì)菌感染可以誘導(dǎo)機體釋放UDP。同時本文以小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7和骨髓來源巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型,采用革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌模式分子Pam3CSK4和LPS刺激巨噬細(xì)胞來模擬細(xì)菌感染過程。結(jié)果顯示,Pam3CSK4和LPS 可以刺激巨噬細(xì)胞釋放UDP,并呈現(xiàn)出時間和劑量依賴的釋放方式。研究結(jié)果表明細(xì)菌感染與UDP的釋放具有相關(guān)性,而且UDP的釋放過程可能與TLR的激活有一定的聯(lián)系。2.Connexin43通道介導(dǎo)UDP的釋放根據(jù)目前的研究報道,胞外核苷酸的釋放與通道蛋白、胞吐作用有關(guān),因此,本研究應(yīng)用膜通道釋放抑制劑CBX、FFA以及胞吐抑制劑NEM預(yù)處理細(xì)胞后,檢測這些抑制劑對UDP釋放的影響。結(jié)果顯示,胞吐抑制劑NEM對細(xì)胞釋放UDP的過程沒有影響,而膜通道釋放抑制劑CBX和FFA均可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的UDP釋放,其中Connexin通道抑制劑FFA抑制效果最為明顯。進(jìn)一步采用RT-PCR的方法,顯示Connexin43 (Cx43)是巨噬細(xì)胞主要表達(dá)的連接蛋白,熒光定量PCR以及Western blot方法均證實LPS刺激可以增加Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過Western blot方法檢測,發(fā)現(xiàn)LPS能夠提高ERK、AKT以及P-65的磷酸化水平。分別應(yīng)用ERK、AKT、P-65磷酸化抑制劑U0126、Ly294002、BAY11后,采用熒光定量PCR的方法,發(fā)現(xiàn)U0126能夠明顯抑制Cx43的表達(dá),而Ly294002和BAY11磷酸化抑制劑沒有明顯的效果。同時,使用Cx43特異性功能抑制劑Gap26以及ERK磷酸化抑制劑U0126預(yù)處理細(xì)胞,并通過熒光偏振技術(shù)檢測UDP含量,發(fā)現(xiàn)二者均能降低UDP的釋放。結(jié)果表明,LPS通過ERK信號通路上調(diào)Cx43的表達(dá),并通過Cx43通道的打開釋放UDP至細(xì)胞外。3.UDP通過P2Y6受體促進(jìn)MCP-1的釋放從而增加機體抗菌能力UDP的特異性受體為嘌呤類受體P2Y6,本文采用UDP特異性受體P2Y6抑制劑MRS2578,并同時構(gòu)建P2Y6敲除小鼠來檢測P2Y6對MCP-1表達(dá)的影響。同時應(yīng)用U0126與Gap26抑制Cx43的表達(dá)與功能,結(jié)果顯示抑制或缺失P2Y6能夠降低由LPS引起的MCP-1的表達(dá),抑制Cx43的表達(dá)與功能也能夠降低LPS誘導(dǎo)的MCP-1的表達(dá)。表明LPS引起的UDP釋放是通過促進(jìn)MCP-1的表達(dá),招募更多單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而增加機體的抗菌能力。在小鼠腹膜炎模型中,細(xì)菌感染前先注射UDP特異性受體抑制劑MRS2578以及UDP釋放抑制劑FFA、U0126、Gap26,均會降低小鼠體內(nèi)清除細(xì)菌的能力,加速小鼠的死亡。這些結(jié)果表明,在細(xì)菌感染過程中,釋放的UDP對于提高小鼠抵抗細(xì)菌感染的能力具有十分重要的作用。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌感染過程中,由于TLR信號通路的激活會引起ERK磷酸化增加,并顯著提高Conenxin43的表達(dá)上調(diào),進(jìn)而促進(jìn)UDP的胞外釋放,胞外釋放的UDP通過自分泌和旁分泌的方式激活其特異性受體P2Y6,誘導(dǎo)細(xì)胞中MCP-1的表達(dá)和釋放,招募更多單核/巨噬細(xì)胞,進(jìn)而提高機體抗菌能力。本研究從危險信號釋放的角度對機體抗菌機制進(jìn)行深入地研究,明確了胞外UDP及其受體在細(xì)菌感染中的重要調(diào)控作用,將固有免疫中的病原體模式識別與危險信號模式識別機制有機地聯(lián)系起來,為深入了解機體的自我免疫調(diào)控機制抵抗細(xì)菌感染過程奠定了理論基礎(chǔ),也為有關(guān)胞外核苷酸的抗菌藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 TLR的激活引起胞外UDP釋放的增加
    一、引言
    二、材料與方法
    三、實驗結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
第二章 細(xì)菌感染過程中UDP釋放機制的研究
    一、引言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
第三章 胞外UDP釋放的抗菌功能研究
    一、引言
    二、材料與方法
    三、結(jié)果
    四、討論與小結(jié)
全文總結(jié)
附錄一
    TABLEⅠ名次縮略
    TABLEⅡ
附錄二
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 錢嘉琳;多細(xì)菌感染通氣相關(guān)性肺炎的發(fā)生率及其預(yù)后[J];國外醫(yī)學(xué)(呼吸系統(tǒng)分冊);2002年06期

2 寧康,石彥明,周玲,于翠香;56例L型細(xì)菌感染的臨床觀察[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2003年22期

3 張沂;段蘊鈾;韓志海;楊寶龍;鄧英賢;;甲磺酸加替沙星氯化鈉注射液治療細(xì)菌感染隨機雙盲對照臨床研究[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報;2006年03期

4 Karavanaki K.;Polychronopoulou S.;Giannaki M. ;朱新菊;;不同病毒和細(xì)菌感染兒童中發(fā)現(xiàn)的一過性和慢性中性粒細(xì)胞減少癥[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(兒科學(xué)分冊);2006年10期

5 劉韞秀;;40例糖尿病足細(xì)菌感染臨床分析與護(hù)理對策[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2010年04期

6 鄒自英;朱冰;吳麗娟;陳雪芹;;不同種屬細(xì)菌感染患者機體免疫功能變化的實驗研究[J];實驗與檢驗醫(yī)學(xué);2011年06期

7 鐘玉虹;;細(xì)菌感染多種檢查方法的對比研究[J];醫(yī)療裝備;2012年08期

8 王心昶,劉旭明,譚朝柱,凌競熙;重癥細(xì)菌感染并發(fā)黃疸33例分析[J];中國實用內(nèi)科雜志;1993年10期

9 端文;;一種罕見的細(xì)菌感染[J];北京工人;1994年08期

10 孫解生,王建華,崔先念;350例L型細(xì)菌感染的觀察[J];當(dāng)代醫(yī)師雜志;1998年07期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 商麗萍;細(xì)胞因子譜對血液病兒童侵襲性肺部真菌與細(xì)菌感染的鑒別診斷作用[D];浙江大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張磊;血液科細(xì)菌感染的病原學(xué)及臨床特點分析[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

2 梁瑞;AvBD6對細(xì)菌感染和應(yīng)激的響應(yīng)及對cLEAP-2表達(dá)的影響[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 丁鳳霞;細(xì)菌感染與嬰幼兒持續(xù)喘息的關(guān)系及抗生素治療療效分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張靈玲;APOM、IL-6等炎癥指標(biāo)與細(xì)菌感染的相關(guān)性分析及聯(lián)合診斷研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2015年

5 張光旭;細(xì)菌感染過程中胞外UDP的釋放及其功能研究[D];華東師范大學(xué);2015年

6 胡可;降鈣素原在細(xì)菌感染中的臨床應(yīng)用研究[D];中南大學(xué);2009年

7 毛壬萍;兒童活體肝移植術(shù)后早期細(xì)菌感染的臨床研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

8 劉滔滔;大鼠血小板和血小板型磷脂酶A_2在宿主防御細(xì)菌感染中的作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2001年

9 高藝航;HNL、PCT、CRP在早期細(xì)菌感染診斷中的作用[D];吉林大學(xué);2015年

10 滕云飛;TLR介導(dǎo)的ATP釋放對抗菌免疫的調(diào)控功能和機制研究[D];華東師范大學(xué);2014年

本文編號：2865148