侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征,腫瘤細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。ECM是存在于細胞與細胞之間的結(jié)締組織, 由多種蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成,構(gòu)成細胞生活的微環(huán)境,以前認為它只能起到細胞與細胞的連接,營養(yǎng),防御,保護與支持作用,并無其它重要功能。自1962年Gross和Lapiere首先報導(dǎo)膠原酶（collagenase）以來,作用于ECM其它成分的蛋白酶相繼被報導(dǎo)。目前證實ECM不僅參與多種細胞的生理過程,如：細胞的遷移、分化、增殖、生殖等過程。而且還參與炎癥、腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移等病理過程,是細胞和細胞之間信號傳遞的橋梁。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶的作用。根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和功能的特點,蛋白水解酶可分為六類：脯肽酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,簡稱MMP)。如今越來越多的證據(jù)表明,腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的能力密切相關(guān)。所以降解ECM的MMPs已成為目前研究的焦點。 基質(zhì)金屬蛋白酶家族是指一系列生理情況下可降解細胞外基質(zhì)及基底膜的鋅離子依賴性內(nèi)肽酶的總稱。這些鋅離子依賴性內(nèi)肽酶通常由纖維母細胞，中性粒細胞，巨噬細胞及腫瘤細胞產(chǎn)生。MMPs家族中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的成員有23余種之 WP=56 多，盡管它們大小不同,底物也不盡相同,但所有的MMPs都含有至少三個相似的結(jié)構(gòu)域?qū)⑵渑c其它金屬蛋白酶區(qū)分開。自氨基端到羧基端依次為：信號肽結(jié)構(gòu)域(signal domain)、前肽結(jié)構(gòu)域(propeptide domain)和催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)。信號肽結(jié)構(gòu)域由17～29個氨基酸組成。緊接著的前肽結(jié)構(gòu)域是由77～87個氨基酸組成的,這個結(jié)構(gòu)域中存在一個高度保守的氨基酸序列：ＰＲＣＧＶＰＤ,其中的半胱氨酸對酶原形式的維持起重要作用,在酶原的激活過程中,這個結(jié)構(gòu)域就會被水解掉。在所有催化結(jié)構(gòu)域中都含有一段十分保守的氨基酸序列：ＨＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三個組氨酸被認為可以與酶活性中心部位Zn2＋結(jié)合而形成配位鍵,從而對酶的催化活性起重要作用。除了MMP—7以外,其他所有MMP在羧基末端都含有一個血結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域(hemopexin),關(guān)于這個結(jié)構(gòu)域的功能還沒有完全搞清楚,它可能介導(dǎo)MMPs與前肽結(jié)構(gòu)域、ECM成分或與MMP抑制劑的結(jié)合。 根據(jù)MMPs的結(jié)構(gòu)特點、生化特征以及作用底物可以將MMPs分為5種類型：間質(zhì)性膠原酶(Interstitial Collagenase)、間質(zhì)溶素(Stromelysin)、 明膠酶(Gelatinase)、膜型金屬蛋白酶(Memberane-type MMPs, MT—MMPs)、新型MMP。 MMPs家族成員都存在以下五個基本特性： ① 都以酶原的形式分泌到ECM中,并在適當(dāng)條件下在該部位被激活而發(fā)揮生理作用。 活性都依賴于Zn2＋的存在,Ca2＋對其活性及穩(wěn)定性也起到一定的作 用。 結(jié)構(gòu)上具有40%～50%的同源性。 ④ 在體內(nèi)存在它們的天然激活劑和抑制劑(MMPs組織抑制因子TIMPs及血漿抑制因子α2 巨球蛋白)。 一般認為活化型 MMPs與其組織抑制因子1∶1比例的結(jié)合將導(dǎo)致MMP功能的抑制。 ⑤ 至少能水解一種ECM成分。 MMPs存在方式有前酶型、活化酶型以及與組織抑制因子結(jié)合的復(fù)合物型。MMPs的存在形式以何種及何型為主與腫瘤的種類及惡性程度密切相關(guān)。MMPs的產(chǎn)生及活化通常在4個水平上調(diào)節(jié)： WP=57 基因轉(zhuǎn)錄水平。 蛋白合成水平。 無活性酶前體經(jīng)蛋白水解酶的作用而激活。 特異性抑制因子的作用。 其中近年的研究熱點集中在后兩個方面，本實驗?zāi)康募礊楸磉_并且復(fù)性出具有生物學(xué)活性的MMP—28而為今后篩選其特異性抑制因子做好準備。 MMPs在胎兒形成、排卵、創(chuàng)傷愈合等過程中起著重要的作用, 功能主要有：降解細胞外基質(zhì)膜有效成分、調(diào)節(jié)細胞粘著、作用于細胞外組分或其他蛋白成分而啟動潛在的生物學(xué)功能、直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理過程。MMPs是ECM重建或降解的生理、病理過程中很重要的酶,是去除細胞遷移屏障的關(guān)鍵酶。MMPs通過分解ECM成分來調(diào)節(jié)其降解和重組之間的動態(tài)平衡,以達到消除某些特殊信號、顯現(xiàn)某些隱含信號、甚至使基質(zhì)中已存在的生物活性物質(zhì)釋放或激活的目的,進而參與細胞和組織器官的各種形態(tài)和功能變化。這些變化既包括各組織和細胞的生長、增殖、分化;生殖過程中子宮內(nèi)膜的周期性變化、排卵、胚泡著床等生理變化，也包括腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移,炎癥的發(fā)生及擴散等病理變化。 MMPs直接作用于細胞的粘附和遷移,而ECM降解的總量是由活化的MMPs和其抑制因子TIMPs的總量的平衡來嚴格控制的。MMPs各成員之間、MMP與其它蛋白水解酶之間存在著密切的聯(lián)系,構(gòu)成了嚴密的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。正是該調(diào)節(jié)機制的精確性,保證了機體內(nèi)生理狀態(tài)下細胞的遷移和細胞外基質(zhì)的重建。而調(diào)節(jié)的失控則成為腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過程發(fā)生的原因。同時，MMPs的過量表達和活化與癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、動脈粥樣硬化、角膜潰瘍、牙周炎等很多疾病有關(guān)。在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中都有MMPs活性的顯著增加。國內(nèi)外相當(dāng)多的研究集中在疾病病理的發(fā)生與發(fā)展,特別是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。在腫瘤細胞中，MMPs的表達水平明顯高于正常細胞，它們能促進腫瘤細胞的生長、分
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：Q55
【部分圖文】：

ＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三個組氨酸被認為可以與酶活性中心部位 Zn2＋合而形成配位鍵,從而對酶的催化活性起重要作用。除了 MMP—7 以外,其他所 MMP 在羧基末端都含有一個血結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域(hemopexin domain),關(guān)于這個構(gòu)域的功能還沒有完全搞清楚,它可能介導(dǎo) MMPs 與前肽結(jié)構(gòu)域、ECM 成分或與MP 抑制劑的結(jié)合。 (圖 1.1)

腫瘤形成過程中MMPs在腫瘤生長、血管生成、腫瘤侵蝕轉(zhuǎn)移及細胞程

動階段中具有一定的作用。本實驗即采用大腸桿菌表達系統(tǒng)，以包重組 MMP-28。包涵體形式表達重組蛋白具有以下優(yōu)點：蛋白表達量高，在每升大腸桿菌培養(yǎng)物中最多可達總蛋白量的30蛋白。表達的蛋白大多數(shù)不會被宿主細胞水解酶所降解。在宿主細胞裂解和初步純化過程中，凝聚的包涵體沒有生物學(xué)活的目的蛋白不會失活。利用離心，過濾或者凝膠層析的方法可以很容易的將包涵體蛋白和溶性蛋白分離。這樣就減少了分離所須的操作并且增加了純化產(chǎn)如果所表達的蛋白對于宿主細胞來說是毒性的，那么無活性的包涵會提高細胞存活的可能性，并產(chǎn)生目的蛋白。包涵體蛋白形成后可以直接用顯微鏡觀察到，而不必等到細胞裂解以確定是否表達。
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本文編號：2861054