侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征,腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一。ECM是存在于細(xì)胞與細(xì)胞之間的結(jié)締組織, 由多種蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成,構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境,以前認(rèn)為它只能起到細(xì)胞與細(xì)胞的連接,營(yíng)養(yǎng),防御,保護(hù)與支持作用,并無(wú)其它重要功能。自1962年Gross和Lapiere首先報(bào)導(dǎo)膠原酶（collagenase）以來(lái),作用于ECM其它成分的蛋白酶相繼被報(bào)導(dǎo)。目前證實(shí)ECM不僅參與多種細(xì)胞的生理過(guò)程,如：細(xì)胞的遷移、分化、增殖、生殖等過(guò)程。而且還參與炎癥、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程,是細(xì)胞和細(xì)胞之間信號(hào)傳遞的橋梁。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶的作用。根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn),蛋白水解酶可分為六類(lèi)：脯肽酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase,簡(jiǎn)稱(chēng)MMP)。如今越來(lái)越多的證據(jù)表明,腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的能力密切相關(guān)。所以降解ECM的MMPs已成為目前研究的焦點(diǎn)。 基質(zhì)金屬蛋白酶家族是指一系列生理情況下可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的鋅離子依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶的總稱(chēng)。這些鋅離子依賴(lài)性?xún)?nèi)肽酶通常由纖維母細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。MMPs家族中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的成員有23余種之 WP=56 多，盡管它們大小不同,底物也不盡相同,但所有的MMPs都含有至少三個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域?qū)⑵渑c其它金屬蛋白酶區(qū)分開(kāi)。自氨基端到羧基端依次為：信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域(signal domain)、前肽結(jié)構(gòu)域(propeptide domain)和催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain)。信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域由17～29個(gè)氨基酸組成。緊接著的前肽結(jié)構(gòu)域是由77～87個(gè)氨基酸組成的,這個(gè)結(jié)構(gòu)域中存在一個(gè)高度保守的氨基酸序列：ＰＲＣＧＶＰＤ,其中的半胱氨酸對(duì)酶原形式的維持起重要作用,在酶原的激活過(guò)程中,這個(gè)結(jié)構(gòu)域就會(huì)被水解掉。在所有催化結(jié)構(gòu)域中都含有一段十分保守的氨基酸序列：ＨＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三個(gè)組氨酸被認(rèn)為可以與酶活性中心部位Zn2＋結(jié)合而形成配位鍵,從而對(duì)酶的催化活性起重要作用。除了MMP—7以外,其他所有MMP在羧基末端都含有一個(gè)血結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域(hemopexin),關(guān)于這個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能還沒(méi)有完全搞清楚,它可能介導(dǎo)MMPs與前肽結(jié)構(gòu)域、ECM成分或與MMP抑制劑的結(jié)合。 根據(jù)MMPs的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生化特征以及作用底物可以將MMPs分為5種類(lèi)型：間質(zhì)性膠原酶(Interstitial Collagenase)、間質(zhì)溶素(Stromelysin)、 明膠酶(Gelatinase)、膜型金屬蛋白酶(Memberane-type MMPs, MT—MMPs)、新型MMP。 MMPs家族成員都存在以下五個(gè)基本特性： ① 都以酶原的形式分泌到ECM中,并在適當(dāng)條件下在該部位被激活而發(fā)揮生理作用。 活性都依賴(lài)于Zn2＋的存在,Ca2＋對(duì)其活性及穩(wěn)定性也起到一定的作 用。 結(jié)構(gòu)上具有40%～50%的同源性。 ④ 在體內(nèi)存在它們的天然激活劑和抑制劑(MMPs組織抑制因子TIMPs及血漿抑制因子α2 巨球蛋白)。 一般認(rèn)為活化型 MMPs與其組織抑制因子1∶1比例的結(jié)合將導(dǎo)致MMP功能的抑制。 ⑤ 至少能水解一種ECM成分。 MMPs存在方式有前酶型、活化酶型以及與組織抑制因子結(jié)合的復(fù)合物型。MMPs的存在形式以何種及何型為主與腫瘤的種類(lèi)及惡性程度密切相關(guān)。MMPs的產(chǎn)生及活化通常在4個(gè)水平上調(diào)節(jié)： WP=57 基因轉(zhuǎn)錄水平。 蛋白合成水平。 無(wú)活性酶前體經(jīng)蛋白水解酶的作用而激活。 特異性抑制因子的作用。 其中近年的研究熱點(diǎn)集中在后兩個(gè)方面，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康募礊楸磉_(dá)并且復(fù)性出具有生物學(xué)活性的MMP—28而為今后篩選其特異性抑制因子做好準(zhǔn)備。 MMPs在胎兒形成、排卵、創(chuàng)傷愈合等過(guò)程中起著重要的作用, 功能主要有：降解細(xì)胞外基質(zhì)膜有效成分、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著、作用于細(xì)胞外組分或其他蛋白成分而啟動(dòng)潛在的生物學(xué)功能、直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織模型再塑及創(chuàng)傷修復(fù)等正常生理過(guò)程。MMPs是ECM重建或降解的生理、病理過(guò)程中很重要的酶,是去除細(xì)胞遷移屏障的關(guān)鍵酶。MMPs通過(guò)分解ECM成分來(lái)調(diào)節(jié)其降解和重組之間的動(dòng)態(tài)平衡,以達(dá)到消除某些特殊信號(hào)、顯現(xiàn)某些隱含信號(hào)、甚至使基質(zhì)中已存在的生物活性物質(zhì)釋放或激活的目的,進(jìn)而參與細(xì)胞和組織器官的各種形態(tài)和功能變化。這些變化既包括各組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化;生殖過(guò)程中子宮內(nèi)膜的周期性變化、排卵、胚泡著床等生理變化，也包括腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,炎癥的發(fā)生及擴(kuò)散等病理變化。 MMPs直接作用于細(xì)胞的粘附和遷移,而ECM降解的總量是由活化的MMPs和其抑制因子TIMPs的總量的平衡來(lái)嚴(yán)格控制的。MMPs各成員之間、MMP與其它蛋白水解酶之間存在著密切的聯(lián)系,構(gòu)成了嚴(yán)密的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。正是該調(diào)節(jié)機(jī)制的精確性,保證了機(jī)體內(nèi)生理狀態(tài)下細(xì)胞的遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的重建。而調(diào)節(jié)的失控則成為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等病理過(guò)程發(fā)生的原因。同時(shí)，MMPs的過(guò)量表達(dá)和活化與癌癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺氣腫、動(dòng)脈粥樣硬化、角膜潰瘍、牙周炎等很多疾病有關(guān)。在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中都有MMPs活性的顯著增加。國(guó)內(nèi)外相當(dāng)多的研究集中在疾病病理的發(fā)生與發(fā)展,特別是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。在腫瘤細(xì)胞中，MMPs的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞，它們能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類(lèi)】：Q55
【部分圖文】：

ＥＸＧＨＸＸＧＸＸＨ,其中的三個(gè)組氨酸被認(rèn)為可以與酶活性中心部位 Zn2＋合而形成配位鍵,從而對(duì)酶的催化活性起重要作用。除了 MMP—7 以外,其他所 MMP 在羧基末端都含有一個(gè)血結(jié)合素樣結(jié)構(gòu)域(hemopexin domain),關(guān)于這個(gè)構(gòu)域的功能還沒(méi)有完全搞清楚,它可能介導(dǎo) MMPs 與前肽結(jié)構(gòu)域、ECM 成分或與MP 抑制劑的結(jié)合。 (圖 1.1)

腫瘤形成過(guò)程中MMPs在腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、腫瘤侵蝕轉(zhuǎn)移及細(xì)胞程

動(dòng)階段中具有一定的作用。本實(shí)驗(yàn)即采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以包重組 MMP-28。包涵體形式表達(dá)重組蛋白具有以下優(yōu)點(diǎn)：蛋白表達(dá)量高，在每升大腸桿菌培養(yǎng)物中最多可達(dá)總蛋白量的30蛋白。表達(dá)的蛋白大多數(shù)不會(huì)被宿主細(xì)胞水解酶所降解。在宿主細(xì)胞裂解和初步純化過(guò)程中，凝聚的包涵體沒(méi)有生物學(xué)活的目的蛋白不會(huì)失活。利用離心，過(guò)濾或者凝膠層析的方法可以很容易的將包涵體蛋白和溶性蛋白分離。這樣就減少了分離所須的操作并且增加了純化產(chǎn)如果所表達(dá)的蛋白對(duì)于宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是毒性的，那么無(wú)活性的包涵會(huì)提高細(xì)胞存活的可能性，并產(chǎn)生目的蛋白。包涵體蛋白形成后可以直接用顯微鏡觀(guān)察到，而不必等到細(xì)胞裂解以確定是否表達(dá)。
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本文編號(hào)：2861054