本文關(guān)鍵詞：基于TAT的聚合物疫苗遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及消化道免疫效果的評(píng)價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：口服疫苗通過(guò)胃腸粘膜進(jìn)行抗原遞送,經(jīng)消化道內(nèi)的免疫應(yīng)答通路產(chǎn)生與常規(guī)注射類似的免疫反應(yīng)。但由于具有免疫原性的物質(zhì)如蛋白,核酸類藥物不穩(wěn)定,進(jìn)入消化道后易受消化道內(nèi)惡劣的酶和pH環(huán)境的影響導(dǎo)致大量被降解;其次,這些大分子藥物難以突破消化道上皮細(xì)胞屏障進(jìn)入粘膜下層與免疫應(yīng)答通路產(chǎn)生相互作用,因而胃腸粘膜對(duì)抗原產(chǎn)生免疫的能力弱,口服免疫所需的抗原量很大,使口服免疫的應(yīng)用受到了限制。隨著醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們發(fā)現(xiàn)采用聚合物納米載體可有效保護(hù)大分子藥物不被降解,延長(zhǎng)在消化道內(nèi)粘膜的滯留時(shí)間,同時(shí)克服胃腸道上皮細(xì)胞屏障,提高抗原與免疫通路的相互作用,有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而備受關(guān)注。本課題以具有免疫原性的大分子——卵清蛋白(OVA)為模型藥物,設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種基于穿膜肽TAT的聚合物藥物載體,即TAT修飾的聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸納米粒(TAT PLGA-γ-PGA NPs)。該疫苗遞送系統(tǒng)利用TAT的高效穿膜作用克服消化道粘膜上皮細(xì)胞屏障,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),為口服疫苗遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供有價(jià)值的參考。本研究第一章對(duì)聚合物納米粒進(jìn)行制備和表征。首先將聚丙交酯乙交酯(PLGA-COOH)與γ-聚谷氨酸(γ-PGA)通過(guò)伸乙二氧基二乙胺基(Eb E)共價(jià)連接合成聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸(PLGA-γ-PGA)共聚物。經(jīng)1H核磁圖譜表征,共聚物PLGA-γ-PGA已成功合成了。再將共聚物PLGA-γ-PGA與穿膜肽TAT共價(jià)連接形成TAT修飾的PLGA-γ-PGA。采用W/O/W復(fù)乳化-溶劑揮發(fā)法制備包載OVA的PLGA-γ-PGA NPs與TAT PLGA-γ-PGA NPs,粒徑分別為(282.5±11.6)nm,(263.8±7.4)nm,粒徑分布較為均一;Zeta電位分別為(-27.9±2.6)m V,(20.0±1.8)m V;載藥量分別為(6.43±0.26)%,(4.54±0.83)%;包封率分別為(68.7±3.0)%,(47.7±9.1)%。掃描電鏡下觀察到兩種聚合物納米載體形態(tài)均為球形,分布均一,具有空洞結(jié)構(gòu)。體外藥物釋放結(jié)果顯示,聚合物納米粒明顯減緩了OVA釋放速度,并且TAT PLGA-γ-PGA NPs的釋藥行為比PLGA-γ-PGA NPs更為緩慢。本研究第二章以Caco-2細(xì)胞為細(xì)胞模型,通過(guò)香豆素6(C6)熒光探針對(duì)聚合物納米粒的細(xì)胞攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行了研究。細(xì)胞攝取結(jié)果顯示,TAT PLGA-γ-PGA NPs在胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯高于PLGA-γ-PGA NPs,且隨著TAT修飾量的增加而增加。表明TAT能夠顯著提高PLGA-γ-PGA NPs細(xì)胞攝取能力。采用不同攝取抑制劑對(duì)聚合物納米粒的攝取機(jī)制進(jìn)行研究,結(jié)果表明TAT PLGA-γ-PGA NPs借助穿膜肽TAT與細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素受體相互作用,并通過(guò)網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白/脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞攝取入胞,而不經(jīng)過(guò)大胞飲。聚合物納米載體胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究結(jié)果顯示,TAT PLGA-γ-PGA NP攝取進(jìn)入細(xì)胞后,胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,而不經(jīng)過(guò)溶酶體。以培養(yǎng)21天后的Caco-2細(xì)胞單層膜為模型,考察聚合物納米�？缒まD(zhuǎn)運(yùn)能力。跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)2h后,在共聚焦顯微鏡下對(duì)Z軸進(jìn)行3D掃描,兩種聚合物納米載體均分布于Caco-2細(xì)胞層BL側(cè),且TAT PLGA-γ-PGA NPs轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯多于PLGA-γ-PGA NPs。同時(shí)有大量TAT PLGA-γ-PGA NPs跨過(guò)了Caco-2單層細(xì)胞膜蓄積在transwell聚碳酸脂膜孔道里,而PLGA-γ-PGA NPs只有少量跨過(guò)。表明TAT PLGA-γ-PGA NPs的跨上皮細(xì)胞屏障的能力要強(qiáng)于PLGA-γ-PGA NPs。本研究第三章以雌性Balb/c小鼠為動(dòng)物模型,評(píng)價(jià)了各聚合物納米�？朔∧c上皮細(xì)胞屏障的能力。以DiO和DiI共標(biāo)記的聚合物納米載體給小鼠灌胃后,2小時(shí)取出十二指腸、空腸和回腸進(jìn)行切片,在共聚焦顯微鏡下觀察兩種聚合物納米載體在各腸段中的吸收分布情況。結(jié)果顯示,PLGA-γ-PGA NPs主要分布在腸腔中,小腸絨毛攝取很少;而TAT PLGA-γ-PGA NPs大量吸附于小腸絨毛表面,同時(shí)大量被攝取進(jìn)入小腸絨毛內(nèi),分布于黏膜固有層。TAT PLGA-γ-PGA NP在小腸絨毛中攝取的量是PLGA-γ-PGA NP的5-6倍。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)兩種納米載體均被小腸淋巴派氏結(jié)攝取,TAT PLGA-γ-PGA NPs在派氏結(jié)中的量是PLGA-γ-PGA NPs的2.2倍。結(jié)果表明TAT PLGA-γ-PGA NPs能夠高效地跨過(guò)了小腸上皮細(xì)胞屏障,進(jìn)入了小腸粘膜固有層和派氏結(jié)淋巴系統(tǒng),增加聚合物納米粒與消化道免疫系統(tǒng)的相互作用。本研究第四章以雌性Balb/c小鼠為動(dòng)物模型,對(duì)載有免疫原性卵清蛋白(OVA)的聚合物納米載體在消化道內(nèi)的免疫反應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。測(cè)定了消化道黏膜免疫所產(chǎn)生的OVA特異性的分泌性IgA(OVA-s IgA)和血液中的OVA特異性抗體Ig G(OVA-sIgG)水平。結(jié)果顯示聚合物納米粒可以通過(guò)口服的形式,有效地遞送疫苗,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)和粘膜免疫反應(yīng)。OAV TAT PLGA-γ-PGA NPs免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的OVA-sIgG和OVA-sIgA量明顯高于其他口服組。表明我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建的TAT PLGA-γ-PGA NPs有效地增加了口服疫苗的遞送,提高了小鼠全身和黏膜免疫應(yīng)答能力,為口服疫苗載體的設(shè)計(jì)提供了有價(jià)值的參考。綜上所述,OVA TAT PLGA-γ-PGA NPs借助于TAT的穿膜作用,能夠高效地跨過(guò)小腸上皮細(xì)胞屏障,提高了聚合物納米粒與粘膜固有層和淋巴系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的相互作用,顯著提高了OVA全身和黏膜免疫應(yīng)答的效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：口服疫苗 卵清蛋白 穿膜肽TAT 聚丙交酯乙交酯-γ-聚谷氨酸(PLGA-γ-PGA)納米粒 跨小腸上皮細(xì)胞屏障 免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392-33
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 第1章 前言14-22
• 1.1 口服藥物胃腸道生理屏障15
• 1.2 跨上皮細(xì)胞屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑15-17
• 1.2.1 細(xì)胞旁路途徑16
• 1.2.2 跨細(xì)胞途徑16-17
• 1.3 聚合物納米�？诜呙邕f送策略17-18
• 1.4 穿膜肽的研究與應(yīng)用18-20
• 1.4.1 穿膜肽的分類18-19
• 1.4.2 CPPs入胞機(jī)制19-20
• 1.4.3 CPPs生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用20
• 1.5 本課題的研究思路20-22
• 第2章 聚合物納米載體的構(gòu)建和表征22-32
• 2.1 材料與儀器22-23
• 2.1.1 試劑22
• 2.1.2 儀器22-23
• 2.1.3 溶液的配制23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-28
• 2.2.1 TAT PLGA-γ-PGA聚合物材料的合成與表征23-25
• 2.2.2 聚合物納米粒的構(gòu)建25-26
• 2.2.3 PLGA-γ-PGA NPs和TAT PLGA-γ-PGA NPs的表征26-27
• 2.2.4 包封率與載藥量測(cè)定27
• 2.2.5 OVA的體外釋放27
• 2.2.6 數(shù)據(jù)處理27-28
• 2.3 結(jié)果與討論28-31
• 2.3.1 TAT PLGA-γ-PGA聚合物材料的合成與表征28
• 2.3.2 PLGA-γ-PGA NPs和TAT PLGA-γ-PGA NPs的表征28-29
• 2.3.3 載藥量與包封率29-30
• 2.3.4 OVA的體外釋放30-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第3章 聚合物納米載體CACO-2 細(xì)胞水平評(píng)價(jià)32-48
• 3.1 材料與儀器32-34
• 3.1.1 試劑32
• 3.1.2 儀器32-33
• 3.1.3 溶液的配制33
• 3.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)33-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-39
• 3.2.1 C6標(biāo)記的聚合物納米粒的制備34
• 3.2.2 C6體外HPLC分析方法的建立34
• 3.2.3 聚合物納米粒C6泄漏實(shí)驗(yàn)34-35
• 3.2.4 Caco-2 細(xì)胞對(duì)聚合物納米粒攝取定性定量研究35-36
• 3.2.5 聚合物納米粒的Caco-2 細(xì)胞攝取機(jī)制研究36-37
• 3.2.6 聚合物納米粒的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究37-38
• 3.2.7 聚合物納米�？鏑aco-2 單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究38-39
• 3.3 結(jié)果與討論39-47
• 3.3.1 C6體外HPLC分析方法的建立39
• 3.3.2 C6標(biāo)記的聚合物納米粒體外泄漏實(shí)驗(yàn)39-40
• 3.3.3 Caco-2 細(xì)胞對(duì)聚合物納米粒攝取定性定量研究40-42
• 3.3.4 聚合物納米粒的Caco-2 細(xì)胞攝取機(jī)制研究42-43
• 3.3.5 聚合物納米粒的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑研究43-45
• 3.3.6 聚合物納米�？鏑aco-2 單層膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究45-47
• 3.4 小結(jié)47-48
• 第4章 聚合物納米載體動(dòng)物水平功能性評(píng)價(jià)48-57
• 4.1 材料和儀器48-49
• 4.1.1 試劑和儀器48
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48-49
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 4.2.1 DiO與DiI熒光標(biāo)記的聚合物納米粒的制備49
• 4.2.2 聚合物納米粒DiO和DiI泄漏實(shí)驗(yàn)49
• 4.2.3 聚合物納米粒在小鼠腸組織中的分布定性定量研究49-50
• 4.3 結(jié)果和討論50-56
• 4.3.1 聚合物納米粒DiO和DiI泄漏實(shí)驗(yàn)50-51
• 4.3.2 聚合物納米粒在小鼠腸組織中的分布定性定量研究51-56
• 4.4 小結(jié)56-57
• 第5章 載卵清蛋白聚合物納米載體消化道免疫評(píng)價(jià)57-63
• 5.1 材料和儀器57-58
• 5.1.1 試劑和儀器57
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57-58
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法58-59
• 5.2.1 OVA制劑的制備58
• 5.2.2 首次免疫誘導(dǎo)58-59
• 5.2.3 二次免疫誘導(dǎo)59
• 5.2.4 全身和粘膜免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)59
• 5.3 結(jié)果與討論59-62
• 5.3.1 全身免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)59-60
• 5.3.2 粘膜免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)60-62
• 5.4 小結(jié)62-63
• 第6章 總結(jié)與展望63-65
• 6.1 全文總結(jié)63-64
• 6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)64
• 6.3 展望64-65
• 致謝65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果72-73
• 綜述 PLGA納米�？诜f藥的研究進(jìn)展和策略73-80
• 參考文獻(xiàn)78-80

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 蔣剛彪;黃志堅(jiān);徐曉鵬;林雅鈴;方羽生;;聚合物納米粒子作為藥物載體的研究與應(yīng)用[J];中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志;2007年12期

2 張麗s，

本文編號(hào)：285999