目的:為了探尋肝臟激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的上游調(diào)控分子,并研究其對LKB1的影響。方法:首先,利用UbiBrowser數(shù)據(jù)庫預(yù)測LKB1可能的上游調(diào)控分子,并根據(jù)評分篩選出可能對LKB1具有調(diào)控作用的Smurf1基因。然后,構(gòu)建Smurf1和LKB1相關(guān)過表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,通過Western blot檢測LKB1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。最后,運(yùn)用熒光定量PCR(qPCR)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)探索Smurf1調(diào)控LKB1可能的分子機(jī)制。結(jié)果:①成功構(gòu)建LKB1和Smurf1相關(guān)過表達(dá)質(zhì)粒。②在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)0、0.5、1、2μg的野生型Smurf1時(shí)其對應(yīng)的LKB1蛋白相對表達(dá)量分別為0.026 2±0.000 7、0.072 7±0.000 3、0.130 1±0.001 3、0.431 5±0.001 0。經(jīng)單因素方差分析,其結(jié)果為F=79 636.433,P=0.000。與0μg對照組相比,進(jìn)一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各組P值分別為0.000、0.000和0.000。③在HEK293T細(xì)胞中過表達(dá)0、0.5、1、2μg的突變型Smurf1時(shí)其對應(yīng)的LKB1的蛋白相對表達(dá)量分別為0.018 0±0.000 1、0.053 0±0.000 4、0.125 0±0.001 0、0.200 4±0.001 7。經(jīng)單因素方差分析,其結(jié)果為F=12 887.993,P=0.000。與0μg對照組相比,進(jìn)一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各組P值分別為0.000、0.000和0.000。④以GAPDH為內(nèi)參,未過表達(dá)Smurf1組和過表達(dá)Smurf1組中,LKB1的相對mRNA表達(dá)水平分別為1.085 1±0.412 5、2.398 2±1.766 9。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,P=0.257。⑤以β-actin為內(nèi)參,未經(jīng)Smurf1處理組、野生型Smurf1(WT)處理組、突變型Smurf1(C699A)處理組中LKB1的相對泛素化水平分別為1.823 8±0.027 8、0.088 1±0.005 1、0.212 7±0.006 2。經(jīng)單因素方差分析,其結(jié)果為F=6 721.953,P=0.000。與未經(jīng)Smurf1處理組相比,進(jìn)一步采用LSD-t法分析,野生型Smurf1組和突變型Smurf1組各組P值分別為0.000和0.000。結(jié)論:這些結(jié)果表明Smurf1通過降低LKB1的多聚泛素化從而參與其蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌株
    1.2 主要試劑
    1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
    1.5 Western blot及Co-Immunoprecipitation檢測相關(guān)蛋白表達(dá)
    1.6 細(xì)胞總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄
    1.7 q RT-PCR
    1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法
2 結(jié)果
    2.1 利用Ubibrowser數(shù)據(jù)庫探尋LKB1上游調(diào)控分子
    2.2 真核過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
    2.3 Smurf1上調(diào)了LKB1表達(dá)并增強(qiáng)了LKB1的穩(wěn)定性
3 討論

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