發(fā)布時(shí)間：2017-04-04 10:18

  本文關(guān)鍵詞：芳香烴受體對NLRP3炎癥小體的調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的NLRP3 (nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor prtein3)炎癥小體是目前研究最深入的炎癥小體,其活化強(qiáng)度被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),例如痛風(fēng)、感染性疾病、Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默氏病、急性移植物抗宿主疾病及癌癥等。因此,針對NLRP3炎癥小體活化調(diào)控及其分子機(jī)制的研究對于闡明這類疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)理,以及尋找免疫調(diào)節(jié)治療的新途徑具有重要的意義。目前,環(huán)境污染越來越受到大家的重視,二惡英類污染物是環(huán)境污染中的主要成分,而二惡英類污染物中毒性最強(qiáng)的是2,3,7,8-四氯-二苯并-對-二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD),其主要通過芳香烴受體(Arylhydrocarbon receptor, AhR)對人體產(chǎn)生影響。近年來,AhR在毒理及癌癥方面已得到深入研究,但對于AhR對免疫系統(tǒng)的調(diào)控效應(yīng)與分子機(jī)制尚未完全明了。本課題深入研究了AhR對NLRP3炎癥小體的調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制,旨在通過闡明NLRP3分子在轉(zhuǎn)錄水平的分子調(diào)控機(jī)制,為尋找防治環(huán)境污染因素造成的炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)療法提供新途徑。材料和方法1.AhR對NLRP3表達(dá)的影響1.1分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,再用LPS刺激不同的時(shí)間(0,4h,8h), Western blot檢測NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1p在蛋白水平的表達(dá)變化。1.2分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,再用LPS刺激不同的時(shí)間(0,2h,4h),RT-PCR檢測NLRP3、AS、caspase-1和IL-1β在mRNA水平的表達(dá)變化。1.3用不同劑量的AhR活化劑TCDD (2nM,10nM,20nM,50nM)和FICZ(20nM,100nM,200nM,500nM)分別刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,再用LPS刺激8h,Western blot檢測NLRP3在蛋白水平的表達(dá)變化。1.4設(shè)計(jì)合成AhR特異性小干擾RNA,用轉(zhuǎn)染試劑將靶向AhR的SiRNA AhR-siRNA以及相應(yīng)的對照CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,并繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞沉淀,Western blot檢測AhR的蛋白表達(dá)情況,明確AhR-siRNA的干擾效率,篩選出抑制效率最佳的干擾片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.5用轉(zhuǎn)染試劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,并繼續(xù)培養(yǎng)48h,用LPS對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行刺激,并于不同的時(shí)間點(diǎn)(0,4h,8h)收集細(xì)胞,通過Western blot檢測NLRP3、ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在蛋白水平的表達(dá)情況。1.6用轉(zhuǎn)染試劑將篩選出的抑制效率高的AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,并繼續(xù)培養(yǎng)48h,用LPS對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行刺激,并于不同的時(shí)間點(diǎn)(0,4h,8h)收集細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA,通過RT-PCR檢測NLRP3、 AS、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β在mRNA水平的表達(dá)情況。2.AhR對NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因活性的影響2.1使用脂質(zhì)體分別將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 tont+166)轉(zhuǎn)染入小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,24h后分別用DMSO和TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。2.2使用脂質(zhì)體將NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 to nt+166)轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,24h后分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kynurenine (L-kyn)刺激細(xì)胞40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。2.3分別將AhR的真核表達(dá)載體pCMV-Myc-AhR和空載體pCMV-Myc轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞株,并篩選鑒定出穩(wěn)定高表達(dá)AhR的細(xì)胞株以及表達(dá)相應(yīng)空載體的細(xì)胞株。向兩種細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染入PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 to nt+166),24h后用LPS刺激細(xì)胞6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。3.AhR調(diào)控NLRP3表達(dá)的分子機(jī)制3.1測序分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的堿基序列,發(fā)現(xiàn)NLRP3啟動(dòng)子區(qū)存在3個(gè)潛在的AhR結(jié)合序列,分別為XRE1 (nt-1512 to-1504)、XRE2(nt-911 to -904)和XRE3(nt+61 to +67)。構(gòu)建一系列含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的不同報(bào)告基因質(zhì)粒,包括：①含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)域的截?cái)囿w質(zhì)粒-2032(nt -2032 to nt+166)、-1434(nt-1434 to nt+166)和-1113(nt-1113 to nt+166);②AhR結(jié)合序列缺失的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)突變體質(zhì)粒ΔXRE-1、ΔXRE-2和ΔXRE-3;③AhR結(jié)合序列突變(GCGTG突變?yōu)锳TACA)的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)質(zhì)粒mt-1、mt-2和mt-3。3.2使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和包含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同截?cái)囿w的報(bào)告基因質(zhì)粒-2032,-1434,-1113分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。3.3使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒-2032,或其AhR結(jié)合序列缺失的突變體質(zhì)粒ΔXRE-1、ΔXRE-2和ΔXRE-3分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,用DMSO、TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。3.4使用脂質(zhì)體將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒-2032,或其AhR結(jié)合序列突變的突變體質(zhì)粒mt-1、mt-2和mt-3分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,培養(yǎng)24h后用DMSO和TCDD刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因的活性。3.5用DMSO、TCDD和FICZ刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞1h,應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。3.6用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA或CTRL-siRNA分別轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)48h后分別用DMSO、TCDD和FICZ刺激1h,應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。4.AhR對NLRP3炎癥小體活化效應(yīng)的影響4.1用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激8h,再分別用ATP、nigericin(Nig)和Alum刺激30min。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中caspase-1的剪切和IL-1p的分泌,以及細(xì)胞裂解液中Pro-caspase-1、Pro-IL-1β和NLRP3的表達(dá)情況。4.2用轉(zhuǎn)染試劑將AhR-siRNA或CTRL-siRNA分別轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)48h后用LPS刺激8h,再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中caspase-1和IL-1p的分泌,以及細(xì)胞裂解液中Pro-caspase-1、 Pro-IL-1β和NLRP3的蛋白表達(dá)情況。4.3用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激不同的時(shí)間(4h和8h),再分別用ATP、Nig和Alum刺激30mmin。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。4.4用不同劑量的TCDD (2nM,10nM,20nM,50nM)刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激8h,再分別用ATP和Nig刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。4.5分別用DMSO、TCDD、FICZ和L-kyn刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激8h,再用ATP刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌情況。4.6用LPS分別刺激pCMV-Myc-AhR質(zhì)粒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和pCMV-Myc空載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系8h,之后用ATP刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1p的分泌情況。4.7用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA和CTRL-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)48h后分別用DMSO和TCDD刺激40min,之后用LPS刺激8h,再分別用ATP、Nig和Alum刺激30min。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1p的分泌情況。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究AhR活化對明礬誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎的影響5.1分別向C57BL/6小鼠腹腔注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬700μg,12h后收集小鼠腹腔灌洗液。腹腔灌洗液經(jīng)超濾管濃縮后,應(yīng)用ELISA檢測小鼠腹腔灌洗液中IL-1β的分泌。5.2分別向C57BL/6小鼠腹腔注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬700μg,12h后收集小鼠腹腔灌洗液,離心收集小鼠腹腔滲出細(xì)胞和腹腔灌洗液(經(jīng)超濾管濃縮),用蛋白裂解液裂解細(xì)胞。應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞裂解液和腹腔灌洗液中caspase-1和IL-1p的剪切,以及細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC和Pro-caspase-1的蛋白表達(dá)。5.3分別向C57BL/6小鼠腹腔注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬700gg,12h后收集小鼠腹腔灌洗液。用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù),并統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組中小鼠腹腔滲出細(xì)胞的總數(shù),中性粒細(xì)胞的數(shù)量,以及Ly6C+單核細(xì)胞的數(shù)量。研究結(jié)果1.AhR負(fù)向調(diào)控NLRP3的表達(dá)水平1.1AhR活化能夠抑制NLRP3在蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激不同的時(shí)間(0,4h,8h),應(yīng)用Western blot檢測NLRP3炎癥小體組分的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,LPS能夠顯著上調(diào)NLRP3的表達(dá),而TCDD刺激后,能夠在蛋白水平顯著減少LPS誘導(dǎo)的NLRP3的表達(dá),而其對ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的蛋白表達(dá)沒有影響。分別用DMSO和TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS進(jìn)行刺激,在不同的時(shí)間點(diǎn)(0,2h,4h)收集細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA,進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示,TCDD刺激后,能夠在mRNA水平顯著減少LPS誘導(dǎo)的NLRP3的表達(dá),而其對ASC、caspase-1和IL-1p的mRNA表達(dá)沒有影響。提示AhR可能通過抑制NLRP3的表達(dá),影響NLRP3炎癥小體的活性。1.2 AhR活化劑對NLRP3表達(dá)的抑制作用具有劑量依賴性用不同劑量的AhR活化劑TCDD (2nM,10nM,20nM,50nM)和FICZ(20nM,100nM,200nM,500nM)刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞40min,之后用LPS刺激8h,收集細(xì)胞,用蛋白裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解,應(yīng)用Western blot檢測NLRP3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,AhR活化劑TCDD和FICZ對NLRP3的表達(dá)具有明顯的抑制效應(yīng),并且這種抑制效應(yīng)具有劑量依賴性。1.3 AhR干擾后能夠增強(qiáng)組成型NLRP3的表達(dá),但對ASC和caspase-1的表達(dá)沒有影響用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA及CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集細(xì)胞,用蛋白裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解,應(yīng)用Western blot檢測NLRP3、ASC和Pro-caspase-1的表達(dá)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染AhR-siRNA后,能夠明顯抑制AhR的表達(dá),增強(qiáng)NLRP3的表達(dá),但對ASC和Pro-caspase-1的表達(dá)沒有影響。1.4 AhR干擾后能夠增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NLRP3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA及CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h,用LPS刺激不同的時(shí)間(0,4h,8h)。收集細(xì)胞,用蛋白裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解,應(yīng)用Western blot檢測NLRP3炎癥小體各組分的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,AhR干擾后能夠顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NLRP3在蛋白水平的表達(dá),而對ASC、Pro-caspase-1和Pro-IL-1β的蛋白表達(dá)沒有影響。用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA及CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h,用LPS刺激不同的時(shí)間(0,2h,4h),收集細(xì)胞,抽提細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR檢測NLRP3炎癥小體各組分在mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果顯示,AhR干擾后能夠顯著增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NLRP3在mRNA水平的表達(dá),而對ASC、caspase-1和IL-1 β的mRNA表達(dá)沒有影響。2 AhR通過與NLRP3的啟動(dòng)子區(qū)XRE序列結(jié)合,抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄2.1 AhR抑制NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒的活性用轉(zhuǎn)染試劑分別將PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別用AhR活化劑TCDD或DMSO對照刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的活性。結(jié)果顯示,AhR活化后能夠顯著抑制NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒的活性。分別將AhR的真核表達(dá)載體pCMV-Myc-AhR和空載體pCMV-Myc轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞株,并篩選鑒定出穩(wěn)定高表達(dá)AhR的細(xì)胞株以及表達(dá)相應(yīng)空載體的細(xì)胞株。向兩種細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染入PGL3質(zhì)粒和NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒(nt-2032 tont+166),24h后用LPS刺激細(xì)胞6h。應(yīng)用報(bào)告基因系統(tǒng)檢測分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的活性。結(jié)果顯示,AhR活化后能夠顯著抑制NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒的活性。提示AhR可能通過作用于NLRP3啟動(dòng)子區(qū),影響NLRP3的轉(zhuǎn)錄。2.2 AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的XRE序列結(jié)合構(gòu)建一系列含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的不同報(bào)告基因質(zhì)粒,包括：①含NLRP3啟動(dòng)子區(qū)不同區(qū)域的截?cái)囿w質(zhì)粒-2032(nt -2032 to nt+166)、1434(nt-1434 to nt+166)和-1113(nt-1113 to nt+166);②AhR結(jié)合序列缺失的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)突變體質(zhì)粒ΔXRE-1、AXRE-2和ΔXRE-3、③AhR結(jié)合序列突變(GCGTG突變?yōu)锳TACA)的NLRP3啟動(dòng)子區(qū)質(zhì)粒mt-1、mt-2和mt-3,并將以上質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別用AhR活化劑TCDD或DMSO對照刺激40min,再用LPS刺激6h。應(yīng)用報(bào)告基因分析NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的活性。結(jié)果顯示,當(dāng)XRE-1和XRE-3缺失或突變時(shí),AhR活化對NLRP3啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因質(zhì)�；钚缘囊种谱饔帽荒孓D(zhuǎn),提示AhR可能與NLRP3的其中兩個(gè)XRE序列結(jié)合(XRE-1和XRE-3)影響NLRP3轉(zhuǎn)錄。用DMSO、TCDD和FICZ分別刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞1h,之后用甲醛固定10min,使用ChIP試劑盒以及膠回收試劑盒,獲取細(xì)胞總DNA,用NLRP3-XRE-1引物.NLRP3-XRE-2引物和NLRP3-XRE-3引物分別進(jìn)行RT-PCR。用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA或CTRL-siRNA分別轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,培養(yǎng)48h后用DMSO、TCDD和FICZ刺激1h,之后用甲醛固定10min,使用ChIP試劑盒以及膠回收試劑盒,獲取細(xì)胞總DNA,用NLRP3-XRE-1引物、NLRP3-XRE-2引物和NLRP3-XRE-3引物進(jìn)行RT-PCR。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,AhR與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的XRE-1和XRE-3結(jié)合,并且AhR活化后能夠增強(qiáng)其與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,而AhR干擾后能夠顯著抑制其與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。因此我們的結(jié)果提示,AhR通過與NLRP3的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生結(jié)合,抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄。3 AhR激活后能夠抑制NLRP3炎癥小體的活化3.1 AhR的活化抑制Pro-caspase-1的剪切用AhR活化劑TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,LPS處理后,進(jìn)一步用ATP、Nig和Alum刺激。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot結(jié)果顯示,AhR的活化能夠顯著抑制細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中Pro-caspase-1的剪切。3.2 AhR干擾后增強(qiáng)Pro-caspase-1的剪切分別將AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h,用LPS處理后,進(jìn)一步用ATP、Nig和Alum刺激。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot結(jié)果顯示,AhR干擾后能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中Pro-caspase-1的剪切。3.3 AhR的活化抑制IL-1β的分泌用AhR活化劑TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,之后用LPS刺激,進(jìn)一步用ATP、Nig和Alum刺激。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot結(jié)果顯示,AhR活化后能夠顯著抑制細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌。用AhR活化劑TCDD刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,之后用LPS刺激,進(jìn)一步用ATP、Nig和Alum刺激；用不同劑量的AhR活化劑TCDD和不同種類的AhR活化劑(TCDD、FICZ和L-kyn)分別刺激小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,之后用LPS刺激,進(jìn)一步用ATP或Nig刺激,收集培養(yǎng)細(xì)胞上清。ELISA結(jié)果同樣顯示,AhR活化能夠顯著抑制培養(yǎng)細(xì)胞上清中IL-1β的分泌。3.4 AhR干擾后增強(qiáng)IL-1β的分泌用轉(zhuǎn)染試劑分別將AhR-siRNA和CTRL-siRNA轉(zhuǎn)染入小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,用LPS處理后,進(jìn)一步用ATP、Nig和Alum刺激。收集細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清,細(xì)胞上清用超濾管進(jìn)行濃縮。Western blot結(jié)果顯示,AhR干擾后能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞裂解液和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌。ELISA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),AhR干擾后能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的分泌。4 AhR抑制明礬誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎4.1 AhR的活化能夠抑制小鼠腹腔灌洗液中IL-1β的分泌向C57BL/6小鼠腹腔分別注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬。收集小鼠腹腔灌洗液,腹腔灌洗液經(jīng)超濾管濃縮。ELISA結(jié)果顯示,AhR活化能夠明顯抑制小鼠腹腔灌洗液中IL-1β的分泌,并且AhR活化同樣抑制了小鼠腹腔灌洗液中TNF-α和IL-6的分泌。4.2 AhR的活化抑制小鼠腹腔灌洗細(xì)胞中Pro-caspase-1的剪切向C57BL/6小鼠腹腔分別注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬。收集小鼠腹腔灌洗液,腹腔灌洗液經(jīng)超濾管濃縮。Western blot結(jié)果顯示,AhR的活化能夠明顯抑制小鼠腹腔灌洗細(xì)胞中Pro-caspase-1的剪切。4.3 AhR活化減少小鼠腹腔中性粒細(xì)胞和Ly6C+單核細(xì)胞的絕對數(shù)量向C57BL/6小鼠腹腔分別注射DMSO、TCDD和FICZ,作用40min后,注射明礬。收集小鼠腹腔灌洗液,流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示,TCDD和FICZ刺激后,明礬誘導(dǎo)的小鼠腹腔滲出細(xì)胞的總數(shù)量、小鼠腹腔中性粒細(xì)胞和Ly6C+單核細(xì)胞的數(shù)量都顯著減少。提示AhR的活化可能抑制NLRP3炎癥小體的活化以及小鼠腹腔免疫細(xì)胞的富集。結(jié)論1.AhR的活化能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NLRP3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。2.AhR能夠與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的XRE序列結(jié)合,抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄。3.AhR的活化能夠顯著抑制NLRP3炎癥小體的活化。創(chuàng)新點(diǎn)及意義1. 本課題首次證實(shí)了AhR能夠在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控NLRP3的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,AhR通過與NLRP3啟動(dòng)子區(qū)的XRE序列結(jié)合,抑制NLRP3的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而影響NLRP3的表達(dá)和NLRP3炎癥小體的活化。2.本課題的研究結(jié)果提供了NLRP3負(fù)向調(diào)節(jié)的分子機(jī)制,預(yù)示著AhR可能作為炎癥小體相關(guān)疾病治療的靶分子,為尋找防治環(huán)境污染因素造成的炎癥性疾病的免疫調(diào)節(jié)療法提供了新途徑。
【關(guān)鍵詞】：NLRP3炎癥小體 芳香烴受體 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 caspase-1 IL-1β
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-17
• ABSTRACT17-26
• 符號說明26-27
• 前言27-30
• 材料和方法30-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-51
• 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 附圖55-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄70-71
• 附件71

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  本文關(guān)鍵詞：芳香烴受體對NLRP3炎癥小體的調(diào)控效應(yīng)和分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：285378