鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的Ca~(2+)結(jié)合蛋白，CaM-Ca~(2+)作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要信號分子，介導(dǎo)調(diào)控由Ca~(2+)引起的一系列生理生化反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動等過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素也同樣存在于動、植物細(xì)胞外，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，神經(jīng)軸突生長，抑制腫瘤壞死因子的釋放，以及促進(jìn)中性粒細(xì)胞蛋白酶分泌等功能，CaM類似于細(xì)胞因子和肽類激素的特征，具有細(xì)胞外信號功能。有關(guān)細(xì)胞外CaM的作用機(jī)制目前尚不清楚。推測細(xì)胞表面可能存在的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(calmodulin-binding proteins, CaMBPs)，是介導(dǎo)細(xì)胞外CaM和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的橋梁，起到傳遞細(xì)胞外CaM信號的作用。用免疫電鏡定位技術(shù)，證實(shí)細(xì)胞表面CaMBPs的存在和觀察其在不同細(xì)胞表面的分布特征，將有助于深入了解細(xì)胞外CaM的作用機(jī)制，及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系，為疾病的診斷和治療提供線索。 已發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞壁存在CaMBPs。為證實(shí)哺乳動物細(xì)胞表面CaMBPs的存在，本研究用10nm膠體金標(biāo)記重組人鈣調(diào)素(金-rhCaM)，分別與人外周血淋巴細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0、人胃癌細(xì)胞MGC803在體外反應(yīng)24h后，用透射電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述三種細(xì)胞表面均可見散在金顆粒分布，用金標(biāo)記BSA代替金標(biāo)記鈣調(diào)素與上述細(xì)胞作用，或淋巴細(xì)胞預(yù)先用未標(biāo)記鈣調(diào)素封閉后再與金-rhCaM反應(yīng)，透射電鏡觀察，細(xì)胞表面均未見金顆粒分布。提示在人外周血淋巴細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0和人胃癌細(xì)胞MGC803表面存在rhCaM結(jié)合位點(diǎn)(Camodulin-binding site, CaMBS)。從透射電鏡結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2／0)和人胃癌細(xì)胞(MGC803)表面CaM結(jié)合位點(diǎn)的密度要高于正常人外周血淋巴細(xì)胞，提示細(xì)胞膜表面CaMBS的分布可能與腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)。 長期以來，鈣調(diào)素被認(rèn)為是真核細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，原核細(xì)胞中也存在鈣調(diào)素樣蛋白。我們此前的工作也證實(shí)外源性CaM可以促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌生長。推測原核生物的細(xì)胞壁也可能存在CaM結(jié)合位點(diǎn)。用金 第__軍醫(yī)大學(xué)領(lǐng)一卜學(xué)位論文 一rllCaM與新鮮培養(yǎng)的卡介苗(減毒牛結(jié)核分枝桿菌)進(jìn)行反應(yīng)，透射電鏡觀察 發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁存在鈣調(diào)素結(jié)合位點(diǎn)。 大量研究表明，CaM結(jié)構(gòu)與功能的異常以及細(xì)胞內(nèi)CaM含量的變化與某些 疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測細(xì)胞內(nèi)外CaM的含量及其與疾病的關(guān)系，將有 助于進(jìn)一步探討CaM的生物學(xué)功能及其在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制和 意義。由于CaM分子結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上的保守性，難以制備特異性的優(yōu)質(zhì)抗體，至 今還沒有理想的CaM檢測試劑盒適合于臨床常規(guī)應(yīng)用。本研究在研制rhCaM和 兔抗CaM抗體的基礎(chǔ)上，通過對聚苯乙烯反應(yīng)板進(jìn)行紫外線照射處理;改善抗 原固相化條件，建立了簡便、快速、準(zhǔn)確的競爭性ELISA定量方法，經(jīng)方法學(xué) 考核，該法具有較高的敏感性，檢測CaM的最低下限為4Ong/ml:重復(fù)性較好， 可用于CaM的定量研究。對淋巴細(xì)胞性白血病9例、非淋巴細(xì)胞性白血病7例、 淋巴瘤7例和82例健康獻(xiàn)血員外周血單個核細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)CaM含量測定結(jié)果表 明，三組患者中外周血單個核細(xì)胞內(nèi)CaM含量分別為1 349.3士206.38fg/cell、 556.06士108.02 fg/cell、1746.05士547.84fg/c ell，顯著高于正常對照組(107.16土56.07 倒cell)(P0.01)。提示白血病和淋巴瘤患者單個核細(xì)胞內(nèi)CaM表達(dá)水平顯著 升高。 特異性抗體的制備是建立高特異、靈敏的ELISA檢測技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。由于 CaM抗原分子量小，無種屬性差異，很難免疫動物獲得高效價(jià)、高親和力的特 異性抗血清。因此也限制了ELISA方法的敏感性。噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展， 為某些難以免疫動物產(chǎn)生特異抗體的抗原，提供了生產(chǎn)單克隆抗體的另一條可行 途徑。為此，我們采用噬菌體顯示技術(shù)，利用重組人鈣調(diào)素為篩選抗原，從人源 性噬菌體抗體庫中篩選抗CaM特異性抗體，以期得到高效、特異的抗CaM抗體。 從天然抗體庫中篩選抗原特異性抗體，篩選效率通常較低，成功率遠(yuǎn)比從免疫抗 體庫中篩選低得多，技術(shù)難度較大。我們經(jīng)過多次篩選方案改進(jìn)，得到了陽性噬 菌體抗體克隆。用ELI SA試驗(yàn)、鈣離子敏感性反應(yīng)試驗(yàn)、膠體金斑點(diǎn)試驗(yàn)(反 相)證實(shí)其抗原特異性。得到了抗原結(jié)合活性較強(qiáng)的人源性CaM單鏈?zhǔn)删w抗 體。我們的改進(jìn)方案可能對其它抗原的抗體庫篩選具有參考意義。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

體(由噬菌體基因改造而成)中，外源性蛋白基因直接插入噬菌體基因中，以寡價(jià)(p川融合)和多價(jià)(p姍融合)展示，因此展示水平較高。如果噬菌體上的p111蛋白都是融合的，空間位阻將阻礙plll與性菌毛結(jié)合，會導(dǎo)致感染能力下降。而p硼融合表達(dá)系統(tǒng)能容納的膚鏈長度有限，妨礙噬菌體的組裝。噬菌粒載體(是噬菌體與質(zhì)粒的雜合體)更適合于展示抗體分子，容易導(dǎo)入新的基因，連接轉(zhuǎn)化效率高，能獲得較大的庫容‘。因此，噬菌體抗體庫多采用噬菌粒作為載體。3.2技術(shù)流程將Fab、ScFv的基因與少量衣殼蛋白基因p川相接，插入噬菌粒載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)F菌毛的大腸桿菌，在宿主菌內(nèi)合成后，抗體融合表達(dá)在plll的N端，借助信號膚穿膜作用，進(jìn)入膜間隙。在輔助噬菌體超感染后，這些抗體片段一plll融合蛋白被包裝于噬菌體尾部。同時(shí)由于輔助噬菌體的復(fù)制缺陷，噬菌粒的DNA被優(yōu)先包裝進(jìn)入噬菌體內(nèi)核，因此攜帶有表達(dá)載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒，并具有再次感染宿主菌進(jìn)行復(fù)制的能力(圖1)。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2853454