發(fā)布時(shí)間：2020-10-20 23:33

　　 骨髓中除含有能分化發(fā)育成各種血細(xì)胞的造血干細(xì)胞之外，還含有產(chǎn)生非造血組織的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，骨髓MSCs由于具有以下特點(diǎn)而日益引起人們的興趣：1．在不同的理化環(huán)境和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，MSCs可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞甚至神經(jīng)元樣細(xì)胞等多種間充質(zhì)細(xì)胞系；2．MSCs是造血支持細(xì)胞，作為滋養(yǎng)層支持造血干細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于具有易分離、擴(kuò)增以及體外操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。 但人們對(duì)MSCs本身的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。至今還未能篩選到MSCs特異性的標(biāo)記分子，尚未能建立鑒定MSCs的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)由于使用的血清的批號(hào)不同等原因，使得不同實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)之間可比性較差。因此尋求MSCs的穩(wěn)定培養(yǎng)條件還有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)從骨髓中分離MSCs，體外培養(yǎng)擴(kuò)增，觀察MSCs的形態(tài)，檢測(cè)不同培養(yǎng)基對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，利用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記的測(cè)定和細(xì)胞周期的分析，并體外誘導(dǎo)MSCs向軟骨方向分化，檢測(cè)軟骨特有的Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，從而了解MSCs的生物學(xué)性狀，探索MSCs的生長(zhǎng)條件。 我們利用密度為1.077g／ml的Ficoll分離液從人骨髓中分離MSCs，分離培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在原代和傳代培養(yǎng)中其形態(tài)學(xué)上觀察均為貼壁、纖維狀的細(xì)胞，隨著代次的增加細(xì)胞形態(tài)更加趨于一致。流式細(xì)胞儀鑒定CD45、CD34、CD117、HLA-DR陰性，CD29、CD166陽(yáng)性，并隨著培養(yǎng)的MSCs代次的增加，陽(yáng)性比率和陰性比率出現(xiàn)相應(yīng)的上升和降低，說(shuō)明細(xì)胞純度增加。第三代的MSCs大約有80％處于G_0／G_1期，S+G_2+M期約20％左右，說(shuō)明MSCs有強(qiáng)大的增殖潛能。MSCs在傳代培養(yǎng)中的最適接種密度約為5.0×10~3／cm~2左右。MSCs在體外經(jīng)歷了滯緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)期三個(gè)時(shí)期，傳代培養(yǎng)的MSCs生長(zhǎng)速度比原代的MSCs明顯快很多。經(jīng)過(guò)比較發(fā)現(xiàn)DMEM-LG培養(yǎng)基是最適合MSCs貼壁和增殖的培養(yǎng)基。采用程 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 序降溫法對(duì)MSCs進(jìn)行凍存，60~90天后對(duì)凍存的MSCs進(jìn)行復(fù)蘇，發(fā)現(xiàn)MSCs仍 可在體外良好生長(zhǎng)4~6代，特定的MSCs樣本可以擴(kuò)增10代，說(shuō)明經(jīng)過(guò)凍存的 細(xì)胞仍具有良好的增殖能力。對(duì)四例標(biāo)本的前三代MSCs在體外利用TGF一pl和 維生素C誘導(dǎo)兩周后，用RT一PCR證明MSCs表達(dá)軟骨特異性的H型前膠原的mRNA， 說(shuō)明我們培養(yǎng)的細(xì)胞具有向軟骨細(xì)胞分化的潛能，由此進(jìn)一步證實(shí)其為MSCs。 在體外MSCS成功地傳代達(dá)7一10代左右。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R329
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
正文
    1 前言
    2 材料與方法
    3 結(jié)果
    4 討論
    5 結(jié)論
    6 參考文獻(xiàn)
綜述
致謝

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 黃榮;山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性、冷凍保存及基因轉(zhuǎn)染研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2849315