植入前遺傳學診斷（Preimplantation genetic Diagnosis，PGD）通過體 外輔助受精、胚胎細胞遺傳學分析，選擇正常胚胎移植，能將人類遺傳病控制 推進到胚胎植入子宮內膜之前，避免了異常妊娠的發(fā)生，具明顯的遺傳優(yōu)生學 意義。但由于PGD的分析材料僅限于1-2個活檢卵裂球細胞，單細胞多聚酶鏈 反應（Polymerase chain reaction，PCR）和熒光原位雜交（Fluorescence in-situ hybridization，F(xiàn)ISH）能提供的遺傳信息非常有限，難以滿足同時 檢測多個基因位點或重復檢測的需要。 全基因組擴增（Whole genome amplification，WGA）技術通過擴增微量 DNA模板甚至單個細胞的整個基因組，再將擴增產(chǎn)物分為多份，作為模板，進 行后續(xù)分析，增加微量DNA分析的遺傳信息量。應用于PGD，實現(xiàn)了單次胚胎活 檢，可分析多種不同基因病或多次重復檢測同種基因病。WGA技術主要有擴增 前引物延伸（Primer extension preamplification，PEP）、退變寡核苷酸引物 PCR（Degenerate oligonucleotide primer-PCR，DOP-PCR）。PEP以隨機組成 2001年浙江人學幀十學位論義 的 15堿基寡核昔酸作為引物，在低溫下連接、延伸，隨機擴增整個基因組 DNA。 DOP—PCR引物序列為 5’－CCGACTCGAGN’N’N’NNNATGTGG－3’，經(jīng)低溫引物 隨機連接和常溫特異引物連接延伸兩步法擴增，按比例均勻擴增整個基因組 D「A。？2P和D0？－？［R的隨機引物眾多，單一循環(huán)的PCR條件無法使所有隨機引 物同時處于良好的復性和延伸狀態(tài)，其擴增全基因組DNA的完整性和擴增效率 尚存許多亟待探討之處。 單細胞PEP用于檢測基因位點的研究國外開展較早，迄今已有利用PEP 進行性別、神經(jīng)節(jié)昔脂病GM。I型、口地中海貧血．、IU：ln血型、高度多態(tài)短串 聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）等基因位點的研究，但尚未見p地中 海貧血 CD17和 nt－28突變基因及連鎖基因（An？rlyl？T）、18和 ZI號染色體特異短 串聯(lián)重復序列 D18551、D21511和 D2151411位點的報道。國內研究才剛剛起步， 僅徐晨明和王敏分別進行單個淋巴細胞、單個胚胎細胞和單個胎兒有核紅細胞 的杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因的檢測。單細胞DOP－PCR全基因組擴增產(chǎn)物目前局 限于比較基因組雜交，檢測全基因組或染色體組缺失和重復，應用于基因病的 檢測報道甚少。若能在DOP－PCR全基因組擴增，CGH染色體非整倍體檢測的 同時，利用其DOP－PCR產(chǎn)物，開展基因病的檢測或篩查，將具有明顯的臨床 應用價值。 第一部分 單細胞PEP多基因位點檢測的研究 目的：探索建立單細胞PEP全基因組擴增，后續(xù)巢式PCR 6地中海貧血 CD17和 nt－28突變基因及連鎖基因（ATTTTTT）、18和 21號染色體短串聯(lián)重復序 列 D18S51、D21Sll和 D2lS1411位點檢測技術，考察單細胞陀P同步檢測上述 基因位點以及囊性纖維病CF A F508及連鎖基因（GATT）、杜氏肌營養(yǎng)不良癥DMD 2 2001年浙江人學J袖十學位論義 基岡外顯子尸和48、Y染色體性別決定基因SRY的擴增準確率，分析單細胞 陀P擴增全基【間mA的完整性。方法：顯微操作獲取單個人淋巴細胞和胚胎 細胞，PEP全基回組擴增，后續(xù)特異性巢式PCR，檢測上述川個基囚位點的單 細胞擴增率（特異產(chǎn)物擴增出現(xiàn)的比率）、假陽性率（陰性管內山現(xiàn)擴增產(chǎn)物 的比率）、假陰性率（川性管內未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物的比率）。擴增準確率（單 細胞利陰性、川性擴增產(chǎn)物的符合率）。結果：1．成功建立單細胞陀P全基 回組擴增，后續(xù)巢式 PCR D地中海貧血 CD17 t［ nt－28突變基因及連鎖基因 （ATI”TT）、18和 21號染色體短串聯(lián)重復序列 D18551、D21511和 D2151411位 點檢測技術。2．成功進行單細胞PEP－巢式PCR，上述基因位點以及綴性纖維病 CF八F508及連鎖基因（GATTTT）、杜氏肌營養(yǎng)不良癥皿D基因外顯子17和48、Y 染色體性別決定基因 SRY 10個位點的同步分析，單個淋巴細胞和單個胚胎細胞 擴增準確率分別達97．17％（583／600）和 gi．58％（174／190）。3．單個淋巴擴增 PEP后續(xù)巢式PCR擴增準確率高于單個胚胎細胞，假陽性率低于胚胎細胞，兩 者有顯著性差異（P＜0．05）。 第二部分 單細胞DOP－PCR多基因位點檢測的研究 日的：探索建立單細胞DOP－PCR全基因組擴增，后續(xù)巢式PCR上述10個 基岡位點的同步檢測技術?
【學位單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2001
【中圖分類】：R710.2;R394.3
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 正 文
前言
第一部分 單細胞PEP多基因位點檢測的研究
    材料與方法
    結果
    討論
第二部分 單細胞DOP-PCR多基因位點檢測的研究
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
四、 綜 述
Ⅰ． 全基因組擴增技術的研究進展
Ⅱ． 熒光PCR在植入前遺傳學診斷的應用
五、 致 謝

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 金帆,黃荷鳳,葉英輝,邢來鳳;單細胞的DOP—PCR—CGH分析[J];中國計劃生育學雜志;1999年08期

2 金帆,黃荷鳳,葉英輝,徐晨明,邢蘭鳳;簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應擴增單細胞全基因組均勻性研究[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2000年08期

本文編號：2847734