目的:制備沉默小鼠B7-2基因的RNAi慢病毒,研究其對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠樹突狀細(xì)胞B7-2基因表達(dá)的干擾效應(yīng)及對其刺激T細(xì)胞增殖的影響。方法:從Gen Bank獲取小鼠B7-2基因序列,在其編碼區(qū)選擇3段RNAi靶序列,構(gòu)建介導(dǎo)B7-2基因RNAi的雙發(fā)夾RNA慢病毒表達(dá)載體,采用DNA測序進(jìn)行重組載體鑒定。重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及包裝輔助質(zhì)粒,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備重組慢病毒并經(jīng)超高速離心進(jìn)行濃縮;濃縮慢病毒顆粒感染293T細(xì)胞,根據(jù)其介導(dǎo)GFP表達(dá)的情況測定病毒滴度。分離C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,采用GM-CSF及IL-4誘導(dǎo)DC的分化,LPS刺激48 h促進(jìn)其成熟,并進(jìn)行形態(tài)以及表型鑒定。采用制備的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒感染小鼠骨髓源DC,流式分析其感染效率及對DC表面B7-2分子表達(dá)的干擾效率;通過慢病毒感染的DC與小鼠脾臟T細(xì)胞混合培養(yǎng)測定慢病毒介導(dǎo)B7-2沉默對DC刺激T細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果:小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建正確;獲得了針對3靶點序列RNAi和陰性對照的濃縮小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒,滴度達(dá)(2～4)×10~8TU/ml,重組慢病毒能夠有效感染DC及抑制其表面的B7-2分子表達(dá),經(jīng)小鼠B7-2基因RNAi慢病毒感染及介導(dǎo)B7-2沉默后,DC刺激T細(xì)胞增殖的能力顯著下降(P0. 05)。結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)小鼠B7-2基因RNA干擾可沉默DC表面B7-2分子的表達(dá)及抑制DC誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖效應(yīng)。
【部分圖文】：

0、20、40、60時感染效率分別為7.1%、25.3%、62.2%、72.8%及86.4%。2.5重組B7-2基因ＲNAi慢病毒感染對DC表面B7-2表達(dá)的沉默效果分析參照陰性對照慢病毒對DC的感染效率，重組慢病毒LV-139、LV-425、LV-848及LV-NC以MO為80感染DC及培養(yǎng)72h，流式分析各組重組慢病毒對DC表面B7-2的干擾效率，結(jié)果顯示(圖7):感染效率進(jìn)一步提高至90%以上，LV-139、LV-425、LV-848感染后DC表面B7-2分子的表達(dá)率分別下降至4.3%、3.8%和6.3%，而圖1小鼠B7-2ＲNAi重組慢病毒表達(dá)載體測序結(jié)果Fig．1DNAsequencingofrecombinantlentiviralvectorspecificformouseB7-2ＲNAi·241·中國免疫學(xué)雜志2019年第35卷

圖2慢病毒包裝過程中GFP的表達(dá)(48h，×100)Fig．2GFPexpressioninlentiviruspackagingprogress(48h，×100)圖3重組慢病毒滴度測定(×100)Fig．3Titrationofrecombinantlentivirus(×100)圖4體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源DC形態(tài)的變化(×400)Fig．4MorphologicalchangesofmouseBM-DCsinprogressofcultureinvitro(×400)圖5小鼠骨髓源DC的表型分析Fig．5PhenotypicanalysisofmouseBM-DCsLV-NC感染組B7-2分子表達(dá)率無明顯變化(73.2%vs71.0%)。根據(jù)以上結(jié)果確定LV-425為具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因ＲNAi重組慢病毒。2.6重組B7-2基因ＲNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達(dá)對DC免疫性能的影響收獲LPS刺激成熟和經(jīng)LV-425或LV-NC感染的DC作為刺激細(xì)胞，以小鼠脾臟T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，二者比例為1∶10進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，共培養(yǎng)72h孔永等慢病毒介導(dǎo)B7-2基因ＲNA干擾對小鼠樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的影響第2期·341·

圖2慢病毒包裝過程中GFP的表達(dá)(48h，×100)Fig．2GFPexpressioninlentiviruspackagingprogress(48h，×100)圖3重組慢病毒滴度測定(×100)Fig．3Titrationofrecombinantlentivirus(×100)圖4體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源DC形態(tài)的變化(×400)Fig．4MorphologicalchangesofmouseBM-DCsinprogressofcultureinvitro(×400)圖5小鼠骨髓源DC的表型分析Fig．5PhenotypicanalysisofmouseBM-DCsLV-NC感染組B7-2分子表達(dá)率無明顯變化(73.2%vs71.0%)。根據(jù)以上結(jié)果確定LV-425為具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因ＲNAi重組慢病毒。2.6重組B7-2基因ＲNAi慢病毒感染及沉默DC表面B7-2表達(dá)對DC免疫性能的影響收獲LPS刺激成熟和經(jīng)LV-425或LV-NC感染的DC作為刺激細(xì)胞，以小鼠脾臟T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，二者比例為1∶10進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，共培養(yǎng)72h孔永等慢病毒介導(dǎo)B7-2基因ＲNA干擾對小鼠樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的影響第2期·341·
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 謝金敏;包杰;董瑞強;楊明;溫浩;;RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞的免疫學(xué)效應(yīng)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年53期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 謝金敏;汪艷;包杰;馬永革;鄒志浩;唐增杰;董瑞強;溫浩;;預(yù)輸注RelB shRNA慢病毒修飾樹突細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受[J];中國組織工程研究;2012年53期

【二級參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 包杰;王前;鄭磊;熊石龍;姜朝新;裘宇容;;核轉(zhuǎn)錄因子RelB抑制途徑對骨髓樹突狀細(xì)胞表面分子表達(dá)的影響研究[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

2 包杰;鄭磊;王前;熊石龍;裘宇容;曾方銀;李娟;;RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓樹突細(xì)胞的免疫學(xué)效應(yīng)觀察[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

3 包杰;王前;鄭磊;曾方銀;劉杰;熊石龍;裘宇容;李娟;;小鼠RelB基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

4 包杰;鄭磊;王前;顧春瑜;裘宇容;李娟;;小鼠骨髓成熟與不成熟樹突狀細(xì)胞中RelB基因的表達(dá)[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年06期

5 包杰;王前;鄭磊;顧春瑜;曾方銀;裘宇容;楊春莉;李娟;;小鼠骨髓成熟與未成熟樹突狀細(xì)胞的生物免疫學(xué)功能比較研究[J];中華風(fēng)濕病學(xué)雜志;2007年02期

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孔永;顏天銘;王玉玉;沈立軍;王婧;邱玉華;;慢病毒介導(dǎo)B7-2基因RNA干擾對小鼠樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的影響[J];中國免疫學(xué)雜志;2019年02期

2 仇素英;慢病毒感染[J];山東醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1979年03期

3 黃傳書;腫瘤壞死因子α對抗原和有絲分裂原誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的增強作用[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);1989年02期

4 聞玉梅;慢病毒感染(綜述)[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料.流行病學(xué)傳染病學(xué)分冊;1977年04期

5 賈琴;張玉英;吳爽;李艷萍;;B7-2基因聯(lián)合自殺基因治療乳腺癌移植瘤模型[J];解剖學(xué)研究;2017年01期

6 白維仁;;慢病毒感染與免疫的關(guān)系[J];醫(yī)師進(jìn)修雜志;1986年05期

7 劉玉華;孫杰;陳明心;郭靜雅;胡玲玲;王艷茹;陳昌友;高增燕;朱曉燕;邱玉華;;B7-2基因工程抗體的制備及體內(nèi)外抗B淋巴瘤作用研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2010年03期

8 沈立軍;孔永;王婧;朱瑩;蔡磊;朱玉強;沈輝;邱玉華;;抗人B7-1及B7-2雙特異性抗體的構(gòu)建、表達(dá)及與抗原結(jié)合的特性分析[J];中國免疫學(xué)雜志;2015年07期

9 王文閣,葛偉文,賀福初,吳祖澤;小鼠免疫共刺激信號B7-2 cDNA的克隆與序列測定[J];中國免疫學(xué)雜志;1997年01期

10 包杰;鄭磊;王前;熊石龍;裘宇容;曾方銀;李娟;;RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓樹突細(xì)胞的免疫學(xué)效應(yīng)觀察[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2009年09期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王增光;大鼠UCHL1基因RNAi重組慢病毒的構(gòu)建、鑒定及功能研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2008年

2 王全楚;HCV C-Fc融合基因疫苗修飾的樹突狀細(xì)胞功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 江小霞;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

4 徐東亮;核因子-κB寡聚脫氧核苷酸誘騙劑處理的供受者樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的實驗研究[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

5 侯萬秋;樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子機制研究[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2004年

6 陳濤涌;來源于人樹突狀細(xì)胞的新型癌基因樣小G蛋白RabJ的生物學(xué)功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

7 葉楓;VEGF對CD34～+造血干/祖細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞分化和功能的影響及其在卵巢癌免疫中的作用和相關(guān)機制[D];浙江大學(xué);2005年

8 俞靜;整合素相關(guān)蛋白（CD47）及其配體對樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)控作用及機制研究[D];浙江大學(xué);2005年

9 閆小毅;發(fā)熱溫度調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞表達(dá)TLR4及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究[D];浙江大學(xué);2005年

10 唐華;內(nèi)皮型脾臟基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞[D];浙江大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉玉華;抗人B7-2人—鼠嵌合抗體的制備及抗腫瘤作用研究[D];蘇州大學(xué);2009年

2 陶然;鼠抗人B7-2單克隆抗體的研制及應(yīng)用研究[D];蘇州大學(xué);2006年

3 陳潔;人B7-2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建及單克隆抗體的研制[D];蘇州大學(xué);2005年

4 鄧捷文;FasL對樹突狀細(xì)胞功能的調(diào)控及在真菌感染中的效應(yīng)研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

5 許潔;Sel1L分子對骨髓源樹突狀細(xì)胞的影響[D];江蘇大學(xué);2018年

6 李叢哲;TLR4-NOD2協(xié)同信號傳遞增強樹突狀細(xì)胞活性及抗結(jié)核分枝桿菌感染的初步研究[D];大理大學(xué);2018年

7 迪麗達(dá)爾·地里夏提;申克孢子絲菌復(fù)合體刺激樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IFN-γ、IL-4及其表達(dá)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2018年

8 何玉潔;TcpC調(diào)控樹突狀細(xì)胞作用機制的研究[D];浙江大學(xué);2017年

9 王嘉良;同時下調(diào)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞CD40表達(dá)水平誘導(dǎo)移植免疫耐受的納米藥物遞送系統(tǒng)研究[D];吉林大學(xué);2017年

10 何栩;硫酸吲哚酚影響人單核細(xì)胞源樹突狀細(xì)胞免疫功能的相關(guān)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

本文編號：2845144