肝細(xì)胞生長因子是一種作用廣泛的細(xì)胞因子，對多種組織細(xì)胞具有重要的調(diào)控作用，包括刺激細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞遷移及抑制細(xì)胞凋亡等。HGF的生物學(xué)效應(yīng)通過不同的信號途徑介導(dǎo)。鞘氨醇-1-磷酸鹽(S1P)是質(zhì)膜鞘磷脂的代謝產(chǎn)物，也是重要的生物活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、分化、死亡等。鞘氨醇激酶(SK)是S1P合成的關(guān)鍵酶，目前被證明是一重要的信號分子。但是，SK是否參與HGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及介導(dǎo)HGF的生物學(xué)效應(yīng)并不清楚。本研究利用肝癌細(xì)胞系HepG2及SMMC-7721為模型，觀察了HGF與SK信號之間的關(guān)系。 我們采用RT-PCR和免疫組化的方法，從基因和蛋白水平分析了HGF受體c-Met、SK及S1P受體EDG-1、EDG-3、EDG-5在HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的表達(dá)情況。這兩個細(xì)胞系高表達(dá)上述分子，因此是研究HGF和SK通路的理想靶細(xì)胞。我們利用MTT法和細(xì)胞遷移測試法觀察到重組HGF對肝癌細(xì)胞只有輕度的刺激增殖作用，但卻有很強的促遷移作用。我們建立了[γ_~(32)P]ATP摻入檢測細(xì)胞內(nèi)SK活性的方法。HGF作用于SMMC-7721細(xì)胞后能明顯增強細(xì)胞內(nèi)SK的活性。已知HGF／c-Met可以激活PI-3K、Rho和MAPK信號通路。PI-3K和MAPK的特異性阻斷劑Ly294002、PD98059可以阻斷HGF對SK的激活作用，表明HGF／c-Met通過MAPK、PI-3K途徑來激活SK，SK是MAPK、PI-3K的下游分子。 為探討SK是否介導(dǎo)HGF的生物學(xué)效應(yīng)，我們采用二甲基鞘氨醇(DMS)阻斷SK通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制SK酶的活性可以明顯阻斷HGF對細(xì)胞的刺激增殖與遷移作用。另外，PI-3K抑制劑Ly294002，MAPK信號通路阻斷劑PD98059具有和DMS類似的效果，而Rho信號通路抑制劑Y27632則對細(xì)胞的增殖和遷移無影響。這些結(jié)果表明HGF／c-Met通過PI-3K和MAPK激活SK，SK參與HGF誘導(dǎo)的促肝癌細(xì)胞增殖和遷移作用。 在上述信號通路研究基礎(chǔ)上，我們建立了不依賴于配體的化學(xué)激活c-Met受體的模型，從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中克隆了c-met基因的胞內(nèi)區(qū)，經(jīng)測序鑒定正確后，構(gòu)建與FKBP相連的融合基因表達(dá)載體。分別通過脂質(zhì)體和磷酸鈣的方法轉(zhuǎn)染 碩士學(xué)位論文:摘要 Mo7e、SMMC一7721細(xì)胞，利用RpPCR和W七stern Blot的方法檢測到細(xì)胞株穩(wěn) 定表達(dá)該基因。用FKBP的結(jié)合藥物APZO 1 87刺激穩(wěn)定表達(dá)融合基因的 SMMC一7721細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)AP加1 87能夠激活胞內(nèi)SK活性，和HGF的激活作用 類似，說明AP20187可以激活c一Mct信號通路。該模型為深入研究細(xì)胞信號途徑， 闡明c一met在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用及在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化中 的作用提供了實驗基礎(chǔ)，為研究孤兒受體的功能提供了技術(shù)平臺。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

1.1HepGZ、7721細(xì)胞RNAo.醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖RNA的方法提取SMMC一7總RNA的OD26o/ODZsoL光度計測OD26o/ODZso比1、859林g/ml、793林留ml，電泳顯示，總RNA的28S常，驗證了總RNA的完整序列設(shè)計了特異性擴增c一cDNA，以此作為模板利A各2陀進(jìn)行RFPCRc一et奮，

斷劑對HGF的遷移阻斷作用。采用信號通路抑制劑預(yù)處理細(xì)胞后，進(jìn)行HGF的促遷移實驗，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果如圖1.13，A:conirol;B為HGF組;C為PD98059+HGF組;D為LY294002+HGF組;E為DMS+HGF組。圖1.14為每組各隨機挑選三個視野計數(shù)遷移細(xì)胞。由圖可看出，應(yīng)用三種阻斷劑后，HGF的促遷移作用被阻斷，其中阻斷作用最明顯的是DMS。綜上說明SK參與了HGF的促增殖、遷移效應(yīng)，且在其中起重要作用。

EeoRI、BamHI切后連接ECORIBamHI圖2.2PI一ZFv載體構(gòu)建示意圖示，用Eeo租、BamHI酶將2XFKBpv基因片段，定向克隆到表達(dá)載體PIRESneo上，命名為Pl一對PI一ZFv質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定:AM
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本文編號：2844596