前言 本研究組于2001年克隆的人α-1B糖蛋白前體基因(α-1Bglycoprotein precursor gene,α-1BGP)，全長(zhǎng)1.6kb，編碼495個(gè)氨基酸。此基因的功能至今仍不清楚。通過同源分析、基因表達(dá)譜分析及結(jié)構(gòu)域分析，推測(cè)α-1B糖蛋白可能在細(xì)胞的增殖過程中起作用。本研究是在原有研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組人生長(zhǎng)激素(GH)、雌激素(β-E2)及脂多糖(LPS)處理人肝癌細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)α-1BGP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；通過基因轉(zhuǎn)染的方法，觀察α-1BGP對(duì)細(xì)胞增殖的影響；最后構(gòu)建pPIczαA-α-1BGP表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染入畢式酵母GS115菌株，從而獲得分泌的重組人α-1B糖蛋白，為進(jìn)一步研究其蛋白功能奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 1．細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 2．Northern雜交和Western Blot相關(guān)試劑 3．Marathon-ReadyTM cDNA Kit和EasySelectTM Pichia Expression Kit 4．pcDNA3.1-α-1BGP及pPIczαA-α-1BGP載體構(gòu)建相關(guān)分子生物學(xué)試劑 5．流式細(xì)胞儀相關(guān)試劑 實(shí)驗(yàn)方法 分別應(yīng)用6nmol／L的GH、10nmol／L的β-E2及10mg／mlLPS處理培養(yǎng)的人肝癌BEL-7402細(xì)胞系，在不同時(shí)段收集細(xì)胞，用Northern雜交分析檢測(cè)這幾種因素對(duì)α-1BGP表達(dá)的調(diào)節(jié)作 用。TRANSFAC4．0軟件和softbeny網(wǎng)站上hSG，hSH，NSITE軟 件共同分析 a－IBGP的 5’上游調(diào)控區(qū)。構(gòu)建了 pcDNA3．l－a－ IBGP的真核細(xì)胞表達(dá)載體，并用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染細(xì)胞， Northern印跡雜交分析轉(zhuǎn)染后 a－IBGP的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析 細(xì)胞周期，檢測(cè)aJBGP對(duì)細(xì)胞增殖的影響。另構(gòu)建了pPIczaA －a叫 酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化GSlls菌株，確定表型，PCR篩選 a－IBGP有效整合酵母基因組的菌株，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS一 PAGE凝膠電泳和Western Blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 GH、p－EZ及IyS處理人肝癌BEL－7402細(xì)胞后，No汕em 印跡雜交分析均顯示 a則 與對(duì)照組相比表達(dá)增高。TRANS－ FAC4．0軟件和softbeny網(wǎng)站上TSSG，TSSH，NSI’fE軟件共同分 析，在a—IBGP轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游J 到一198區(qū)域存在TATA 盒，在其附近及其5’上游遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)區(qū)存在多個(gè)API，C／EBP結(jié)合 位點(diǎn)，并且在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游人 到一 處存在一個(gè) C－FOS 結(jié)合基序。成功構(gòu)建了 pcDNA3．l－a則 表達(dá)載體，Northern 印跡雜交顯示轉(zhuǎn)染 72 ／J’時(shí)后，a刁 表達(dá)明顯增高。細(xì)胞周 期分析顯示轉(zhuǎn)染72小時(shí)后的細(xì)胞，與對(duì)照組相比對(duì)指數(shù)增高， GO／GI期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，GZ／M期細(xì)胞增高不明顯。成 功的構(gòu)建了 pPIczaA－a－IBGP表達(dá)載體，用線性 pPIczaA－。－ IBGP及pPIc加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染畢式酵母GSlls 菌株，提取GSlls－a 叫 酵母 DNA，PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明 a則 已有效地 整合酵母基因組中。誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，SDS－ PAGE電泳結(jié)果在分子量 66．2－43 KDa之間有一條逐漸增加的 帶，在第7天達(dá)到最強(qiáng)，分子量接近預(yù)測(cè)大小門4．ZKDa人West－ em－Blot結(jié)果在 66．2－43KDa之間可見一條微弱的特異性帶，而 對(duì)照組未見。 ·2· 討”論 人 a一 糖蛋白前體基因（a－IBGP）自克隆以來關(guān)于它的 功能及在人類疾病中所發(fā)揮的作用一直都不清楚。我們利用生長(zhǎng) 激素（GH）處理肝癌 BEL－7442細(xì)胞系，a－IBGP的表達(dá)明顯高 于對(duì)照組，說明 GH可以調(diào)節(jié) a－IBGP的表達(dá)，該基因可能參與 GH的生理功能及在與GH相關(guān)的疾病中發(fā)揮作用。GH對(duì)基因 的調(diào)節(jié)，一部分是直接作用的，而另外一部分是通過轉(zhuǎn)錄因子的誘 導(dǎo)表達(dá)，與其有關(guān)聯(lián)的順式作用元件的結(jié)合后，改變基因的轉(zhuǎn)錄水 平。為了了解 GH是通過何種途徑調(diào)節(jié) a－IBGP表達(dá)，我們分析 了 a－IBGP的 5’端調(diào)控區(qū)，臺(tái)果發(fā)現(xiàn)了普遍存在的 API，C／EBP 結(jié)合基序，而且還存在著一個(gè)（，－fOS結(jié)合基序，所以推測(cè)GH可能 通過誘導(dǎo) c－fos，c一 表達(dá)增高，結(jié)合于 a－IBGP調(diào)控區(qū)的特 異性 DNA反應(yīng)元件，促進(jìn)它的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)血清中人 a河 糖蛋白在絕經(jīng)前女性中的含量比同年齡段的男性高。而GH的分 泌在人類中存在性別差異，女性表現(xiàn)了較高的基礎(chǔ)水平。所以可 能是由于 GH分泌的性別差異，a—IBGP在不同水平 GH的調(diào)節(jié) 下表達(dá)不同，導(dǎo)致了人a－IB糖蛋白血清中含量的性別不同。因 此 a人 可能是一種新的依靠性別特異分泌模式的生長(zhǎng)激素 靶基因，參與GH在不同性別中的特異作用。 我們采用基因轉(zhuǎn)染結(jié)合流式細(xì)胞儀的方法分析細(xì)胞周期，結(jié) 果顯示轉(zhuǎn)染之后的細(xì)胞，GO／GI期細(xì)胞減少／期細(xì)胞和PI指數(shù) 均有增加，說明了 a－IBGP對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞具有增殖作用， 可能是觸發(fā)細(xì)胞通過m期限．制點(diǎn)，進(jìn)人S期，而發(fā)揮增殖作用 的。我們的研究還發(fā)現(xiàn)GH、雌激素和e都可以在體外培養(yǎng)的 ·3· 細(xì)胞中誘導(dǎo)a－IBGP表達(dá)增高，說明其是幾種不同因素作用于細(xì) 胞，觸發(fā)不同途徑的共有的下游基因，所以它可能對(duì)這幾種因素的 相似功能起一定的作用。而以往的研究表明GH、雌激
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q78
【部分圖文】：

peDNA3.1一a一IBGP真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建

pPICzaA一a一IBGP酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

二‘琴豁對(duì)膠GR3GHE，GR3GR12確賺三娜爵二GHI已GH24圖3a一IBGP在hGH處理后各時(shí)段的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞中(con-troI)的表達(dá)。(A為特異性探針雜交的結(jié)果，B為日一ac血對(duì)照)2.p一E2在人肝癌BEL一7402細(xì)胞中誘導(dǎo)a’一IBGP表達(dá)增高肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈梭形，貼壁生長(zhǎng)。提取p一EZ處堅(jiān)理3，9，12，15，24hr，及對(duì)照組培養(yǎng)3、12、24hr的細(xì)胞RNA
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本文編號(hào)：2844451