α毒素是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens type A，CPA)引起氣性壞疽的最主要致死因素，也是重要的生物毒素戰(zhàn)劑，目前尚無有效的防治方法。克隆A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因，實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中的高效表達(dá)，研究重組毒素的生物學(xué)活性及免疫學(xué)活性，對(duì)α毒素的檢測(cè)、疫苗及抗毒素的制備具有重要意義。 用PCR方法從A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株NCTC64609中擴(kuò)增到了α毒素全基因(cpa1229基因)及C端片段(cpa408基因)，將兩片段分別克隆至pMD18-T Vector測(cè)序鑒定后，置于含PRPL啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pBV220的受體菌DH5α中，經(jīng)42℃溫度誘導(dǎo)，cpa408基因在分子量約15KD處得到了高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)43.75％且表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶形式存在。經(jīng)Western blot鑒定，表達(dá)蛋白能被抗α毒素血清所識(shí)別。將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)80％飽和硫酸銨一次沉淀后，進(jìn)行透析，上凝膠過濾層析柱分離純化，得到了純度95％以上的表達(dá)目的蛋白。用純化的表達(dá)產(chǎn)物，腹腔注射免疫昆明小鼠，進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果免疫組8只小鼠全部存活，得到了100％的保護(hù)，而對(duì)照組8只小鼠全部死亡。同時(shí)，多點(diǎn)肌肉注射免疫SPF級(jí)30周齡產(chǎn)蛋雞；收集免疫后雞每周所產(chǎn)蛋，混和卵黃液提取雞卵黃抗體IgY后，取適量樣品，ELISA法測(cè)定卵黃液中抗體滴度值，結(jié)果所制備的抗體滴度一般在1：6400至1：12800之間，最高值達(dá)1：25600；以雙向免疫擴(kuò)散和ELISA方法，用IgY和標(biāo)準(zhǔn)抗α毒素血清檢測(cè)cpa408表達(dá)蛋白及A型產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC64609濃縮培養(yǎng)上清，兩者均能與IgY及標(biāo)準(zhǔn)抗α毒素血清特異反應(yīng)。 昆明小鼠主動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)及雞卵黃抗體制備實(shí)驗(yàn)顯示，cpa408基因表達(dá)產(chǎn)物具有良好免疫原性，其免疫昆明小鼠后產(chǎn)生的抗體對(duì)小鼠具有保護(hù)作用，從而為下一步α毒素疫苗及抗毒素的研究奠定了基礎(chǔ)，所制備的IgY抗體為α毒素的檢測(cè)提供了可靠的材料。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R392.1
【部分圖文】：

1.1cpa基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定1.cpa1229基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)2.cpa4OS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M:DLZ，000DNAMarker(2000，1000，750，500，250，IOObpa基因快速連接后，轉(zhuǎn)化至受體篩選培養(yǎng)，挑取白色菌落PCR切鑒定，結(jié)果切出1229bp大小陽(yáng)性克隆質(zhì)粒中含有Cpa1229基

瓊脂平板進(jìn)行藍(lán)白菌落篩選培養(yǎng)，挑取白色菌落PCR擴(kuò)增鑒定，同時(shí)提取質(zhì)粒并進(jìn)行EcoRI/PStl雙酶切鑒定，結(jié)果切出1229bp大小及408bp大小的外源基因片段(見圖1.2)，表明陽(yáng)性克隆質(zhì)粒中含有Cpa1229基因及cPa408基因片段。

隨機(jī)挑取克隆菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性者，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見有408bp及1229bp大小的片段，說明cpa408基因片段及Cpa1229基因片段已克隆至表達(dá)載體中，見圖1.5。圖1.5重組表達(dá)質(zhì)粒pBV/cpa408雙酶切鑒定1.表達(dá)質(zhì)粒pBV22O;.重組表達(dá)質(zhì)粒pBv/epa4OSEeoRI、Pstl雙酶切:.重組表達(dá)質(zhì)粒pBV/epa1229EeoRI、Pstl雙酶切;M:DL2000Marker(2000，1000，750，500，250，IOObp)
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張智清,姚立紅,侯云德;含P_RP_L啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用[J];病毒學(xué)報(bào);1990年02期

2 趙寶華,許崇波,馮書章,朱平;抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素單鏈抗體基因的表達(dá)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2000年04期

3 許崇波,朱平,姚湘燕,王卓,馮書章,馬從林,孟銳奇;產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素保護(hù)性抗原基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);1999年01期

本文編號(hào)：2844432