斯氏貍殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因表達、鑒定、組織學定位及在臨床實驗診斷中應用的研究

發(fā)布時間：2020-10-16 06:21

　　背景：斯氏貍殖吸蟲[Pagumogonimus skrjabini (Chen,1959) Chen,1963]散在流行于我國四川、重慶、甘肅、福建等15個省、市、自治區(qū)，國外尚沒有該蟲種流行的報道。由于人為該寄生蟲的非正常宿主，幼蟲侵入人體后，不能到達肺部寄生、因而不能發(fā)育至成蟲，蟲體滯留于童蟲階段。由于童蟲在體內(nèi)組織、器官間的游走、移行，常常引起游走性皮下包塊或結節(jié)、腦占位性病變和內(nèi)臟損傷等肺外型寄生蟲表現(xiàn)，造成肺外多器官、組織的損害。根據(jù)其不同寄生部位臨床表現(xiàn)多種多樣，臨床癥狀也不典型，因而誤診率非常高, 給人們的健康，尤其兒童和流行區(qū)經(jīng)濟建設造成極大的危害。由于該蟲體在人體內(nèi)寄生的特點決定了病原學診斷是比較困難的，因而免疫學檢查在該型肺吸蟲病的實驗室診斷和鑒別診斷中尤其重要。近年來由于多數(shù)斯氏貍殖吸蟲病流行區(qū)的生態(tài)環(huán)境己經(jīng)或正在發(fā)生變化，溪蟹的感染率尚較高，但體內(nèi)囊蚴的感染密度較以往大大降低，這就給本病的實驗研究，尤其是免疫診斷抗原的制備帶來一定困難。目前，國內(nèi)實驗室免疫診斷用抗原仍然是使用天然抗原，主要為成蟲的粗提抗原，其次為排泄分泌抗原。隨著天然抗原的來源逐漸減少，直接影響免疫診斷抗原的質(zhì)量以及抗原的標準化。近年來也有一些增加蟲體抗原提取量的研究，如易德友報告了可以高效利用蟲體成分的尿素溶解性抗原。然而這并不能從根本上解決日益突出的免疫診斷抗原的缺乏的問題。半胱氨酸蛋白酶存在于人類、寄生生物等多種動物體內(nèi)，多種寄生蟲都能合成或分泌半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶作為寄生蟲的主要消化酶之一，在寄生蟲與宿主的相互關系上具有重要的作用。同時該酶還是許多寄生蟲的免疫優(yōu)勢抗原，具有明顯的種、屬特異性。因而斯氏貍殖吸蟲半胱氨酸蛋白酶的表達，對于斯氏貍殖吸蟲所致疾病的致病性、免疫性、與宿主相互關系的研究，以及該病的診斷、預防，均具有重要意義。目的：1、構建斯氏貍殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因片段－PinPointTM Xa-1 T載體重組分子。2、將重組分子轉化到大腸桿菌JM109菌株中去。3、進行原核表達，獲得融合蛋白，并檢測其免疫反應性。4、用表達的融合蛋白的粗提物作為診斷抗原， WP=7 采用cystatin 捕獲ELISA方法，對15例已經(jīng)明確診斷的臨床標本(5例斯氏貍殖吸蟲感染的病人，5例華支睪吸蟲感染的病人，5例日本裂體吸蟲感染的病人)進行檢測，對其在臨床實驗診斷的應用價值進行評估。5、進行半胱氨酸蛋白酶在成蟲蟲體內(nèi)的組織學定位。方法：1、將含有斯氏貍殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因片段的DH5α菌株接種于5 ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB中37℃，250 rpm振蕩過夜培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴增目的基因片斷，膠純化、回收后與PinPointTM Xa-1T載體相連，并導入到大腸桿菌JM109菌株中去。用特異引物擴增所有獲得的氨芐抗性菌株的質(zhì)粒。能夠擴增出目的基因片斷的陽性菌株進行測序鑒定。經(jīng)測序鑒定證實為正確連接的菌株，取其過夜培養(yǎng)物按1:100加入到含生物素2μM的氨芐抗性的LB中37℃，振蕩培養(yǎng)1h后，加入終濃度為100μM IPTG誘導，37℃，振蕩培養(yǎng)4～5h使其表達編碼的多肽片段。用裂解液制備抗原標本，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭染色檢測其表達情況，同時將其轉移到NC膜上，用生物素親合素系統(tǒng)染色，觀察融合蛋白表達情況。用免疫印跡初步鑒定其免疫反應性。將超聲破碎法制備的重組抗原，采用重組抗原Cystatin 捕獲-ELISA方法，首先以已知效價的抗血清測定抗原的效價。然后用確定效價的重組抗原分別檢測斯氏貍殖吸蟲、華支睪吸蟲和日本裂體吸蟲病人血清并對其臨床應用價值作出初步評估。通過免疫組化的方法對斯氏貍殖成蟲進行半胱氨酸蛋白酶體內(nèi)表達的蟲體組織學定位。結果：轉化實驗共獲得21株氨芐抗性的菌株。全部增菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR擴增目的基因片段，證實有8株含有目的基因片段，分別命名為A1～A8。測序后經(jīng)過與標準序列比對鑒定證實，A7正向連接，A1、A3、A4、A5、A6反向連接（A2、A8未能測出）。成功構建了PinPointTM Xa-1T-半胱氨酸蛋白酶基因片段的重組分子。分別取空菌株、正向、反向連接菌株，經(jīng)過誘導表達，制備重組抗原標本，SDS-PAGE后，經(jīng)考馬斯亮蘭染色，空菌株、正向、反向連接菌株之間無明顯差異。轉膜后生物素－鏈親合素－堿性磷酸酶系統(tǒng)染色顯示空菌株有一22.5kDa大小的弱帶，該蛋白應為大腸桿菌本身表達的一種內(nèi)源性生物素化蛋白，量較少。正向連接菌株除22.5kDa大小的弱帶外，在32 kDa處有一融合蛋白條帶，反向連接菌株與之相似，也出現(xiàn)一條表達帶，但分子量遠小于預期值，僅僅14kDa左右。Western-blotting顯示僅正向連接菌株在32 kDa的位置有一陽性染色條帶。用超聲破碎法制備的重組抗原的Cystatin 捕獲-ELISA檢測15份已知病人血清學標本（其中斯氏貍殖吸蟲感染的病人血清學標本5 WP=8 份，日本裂體吸蟲感染患者血清標本5份，華支睪吸蟲感染病人血清標本5份，3份健康正常人血清作陰性對照），結果顯示僅斯氏貍殖吸蟲的病人血清出現(xiàn)強陽性反應，其余皆為陰性反應(p﹤0.01)。免疫組織化學染色顯示在斯氏貍殖吸蟲成蟲蟲體橫切面上，腸管上皮及表皮出現(xiàn)陽?
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R383
【部分圖文】：

氨基酸序列,半胱氨酸蛋白酶,吸蟲,結構示意圖

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