背景：斯氏貍殖吸蟲[Pagumogonimus skrjabini (Chen,1959) Chen,1963]散在流行于我國(guó)四川、重慶、甘肅、福建等15個(gè)省、市、自治區(qū)，國(guó)外尚沒有該蟲種流行的報(bào)道。由于人為該寄生蟲的非正常宿主，幼蟲侵入人體后，不能到達(dá)肺部寄生、因而不能發(fā)育至成蟲，蟲體滯留于童蟲階段。由于童蟲在體內(nèi)組織、器官間的游走、移行，常常引起游走性皮下包塊或結(jié)節(jié)、腦占位性病變和內(nèi)臟損傷等肺外型寄生蟲表現(xiàn)，造成肺外多器官、組織的損害。根據(jù)其不同寄生部位臨床表現(xiàn)多種多樣，臨床癥狀也不典型，因而誤診率非常高, 給人們的健康，尤其兒童和流行區(qū)經(jīng)濟(jì)建設(shè)造成極大的危害。由于該蟲體在人體內(nèi)寄生的特點(diǎn)決定了病原學(xué)診斷是比較困難的，因而免疫學(xué)檢查在該型肺吸蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷和鑒別診斷中尤其重要。 近年來由于多數(shù)斯氏貍殖吸蟲病流行區(qū)的生態(tài)環(huán)境己經(jīng)或正在發(fā)生變化，溪蟹的感染率尚較高，但體內(nèi)囊蚴的感染密度較以往大大降低，這就給本病的實(shí)驗(yàn)研究，尤其是免疫診斷抗原的制備帶來一定困難。目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室免疫診斷用抗原仍然是使用天然抗原，主要為成蟲的粗提抗原，其次為排泄分泌抗原。隨著天然抗原的來源逐漸減少，直接影響免疫診斷抗原的質(zhì)量以及抗原的標(biāo)準(zhǔn)化。近年來也有一些增加蟲體抗原提取量的研究，如易德友報(bào)告了可以高效利用蟲體成分的尿素溶解性抗原。然而這并不能從根本上解決日益突出的免疫診斷抗原的缺乏的問題。 半胱氨酸蛋白酶存在于人類、寄生生物等多種動(dòng)物體內(nèi)，多種寄生蟲都能合成或分泌半胱氨酸蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶作為寄生蟲的主要消化酶之一，在寄生蟲與宿主的相互關(guān)系上具有重要的作用。同時(shí)該酶還是許多寄生蟲的免疫優(yōu)勢(shì)抗原，具有明顯的種、屬特異性。因而斯氏貍殖吸蟲半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)，對(duì)于斯氏貍殖吸蟲所致疾病的致病性、免疫性、與宿主相互關(guān)系的研究，以及該病的診斷、預(yù)防，均具有重要意義。 目的：1、構(gòu)建斯氏貍殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因片段－PinPointTM Xa-1 T載體重組分子。2、將重組分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109菌株中去。3、進(jìn)行原核表達(dá)，獲得融合蛋白，并檢測(cè)其免疫反應(yīng)性。4、用表達(dá)的融合蛋白的粗提物作為診斷抗原， WP=7 采用cystatin 捕獲ELISA方法，對(duì)15例已經(jīng)明確診斷的臨床標(biāo)本(5例斯氏貍殖吸蟲感染的病人，5例華支睪吸蟲感染的病人，5例日本裂體吸蟲感染的病人)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其在臨床實(shí)驗(yàn)診斷的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。5、進(jìn)行半胱氨酸蛋白酶在成蟲蟲體內(nèi)的組織學(xué)定位。 方法：1、將含有斯氏貍殖吸蟲成蟲半胱氨酸蛋白酶基因片段的DH5α菌株接種于5 ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB中37℃，250 rpm振蕩過夜培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因片斷，膠純化、回收后與PinPointTM Xa-1T載體相連，并導(dǎo)入到大腸桿菌JM109菌株中去。用特異引物擴(kuò)增所有獲得的氨芐抗性菌株的質(zhì)粒。能夠擴(kuò)增出目的基因片斷的陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)為正確連接的菌株，取其過夜培養(yǎng)物按1:100加入到含生物素2μM的氨芐抗性的LB中37℃，振蕩培養(yǎng)1h后，加入終濃度為100μM IPTG誘導(dǎo)，37℃，振蕩培養(yǎng)4～5h使其表達(dá)編碼的多肽片段。用裂解液制備抗原標(biāo)本，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮蘭染色檢測(cè)其表達(dá)情況，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移到NC膜上，用生物素親合素系統(tǒng)染色，觀察融合蛋白表達(dá)情況。用免疫印跡初步鑒定其免疫反應(yīng)性。將超聲破碎法制備的重組抗原，采用重組抗原Cystatin 捕獲-ELISA方法，首先以已知效價(jià)的抗血清測(cè)定抗原的效價(jià)。然后用確定效價(jià)的重組抗原分別檢測(cè)斯氏貍殖吸蟲、華支睪吸蟲和日本裂體吸蟲病人血清并對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值作出初步評(píng)估。通過免疫組化的方法對(duì)斯氏貍殖成蟲進(jìn)行半胱氨酸蛋白酶體內(nèi)表達(dá)的蟲體組織學(xué)定位。 結(jié)果：轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)共獲得21株氨芐抗性的菌株。全部增菌后提取質(zhì)粒，經(jīng)過PCR擴(kuò)增目的基因片段，證實(shí)有8株含有目的基因片段，分別命名為A1～A8。測(cè)序后經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)鑒定證實(shí)，A7正向連接，A1、A3、A4、A5、A6反向連接（A2、A8未能測(cè)出）。成功構(gòu)建了PinPointTM Xa-1T-半胱氨酸蛋白酶基因片段的重組分子。分別取空菌株、正向、反向連接菌株，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)，制備重組抗原標(biāo)本，SDS-PAGE后，經(jīng)考馬斯亮蘭染色，空菌株、正向、反向連接菌株之間無明顯差異。轉(zhuǎn)膜后生物素－鏈親合素－堿性磷酸酶系統(tǒng)染色顯示空菌株有一22.5kDa大小的弱帶，該蛋白應(yīng)為大腸桿菌本身表達(dá)的一種內(nèi)源性生物素化蛋白，量較少。正向連接菌株除22.5kDa大小的弱帶外，在32 kDa處有一融合蛋白條帶，反向連接菌株與之相似，也出現(xiàn)一條表達(dá)帶，但分子量遠(yuǎn)小于預(yù)期值，僅僅14kDa左右。Western-blotting顯示僅正向連接菌株在32 kDa的位置有一陽(yáng)性染色條帶。用超聲破碎法制備的重組抗原的Cystatin 捕獲-ELISA檢測(cè)15份已知病人血清學(xué)標(biāo)本（其中斯氏貍殖吸蟲感染的病人血清學(xué)標(biāo)本5 WP=8 份，日本裂體吸蟲感染患者血清標(biāo)本5份，華支睪吸蟲感染病人血清標(biāo)本5份，3份健康正常人血清作陰性對(duì)照），結(jié)果顯示僅斯氏貍殖吸蟲的病人血清出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，其余皆為陰性反應(yīng)(p﹤0.01)。免疫組織化學(xué)染色顯示在斯氏貍殖吸蟲成蟲蟲體橫切面上，腸管上皮及表皮出現(xiàn)陽(yáng)?
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R383
【部分圖文】：

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圖 3 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后,擴(kuò)增產(chǎn)物 1％瓊脂糖凝膠電泳回收1 Mark 2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物氏貍殖吸蟲半胱氨酸蛋白酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物，回收后 1％瓊脂糖凝電泳僅看到在大約 500bp 處一條清晰銳利的條帶。1 Mark 2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

SDS-PAGE電泳膠考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2842890