表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）屬于一種酪氨酸蛋白激酶(TPK)，當(dāng)EGFR與其配體EGF結(jié)合后導(dǎo)致二聚化并激活內(nèi)在的TPK活性，催化胞內(nèi)域受體自身磷酸化以及下游底物磷酸化，引發(fā)信號(hào)傳遞途徑，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。除了調(diào)節(jié)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)外，EGFR在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)，這種過表達(dá)增強(qiáng)了TPK活性，而且與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此，建立EGFR/TPK抑制劑篩選方法或模型對(duì)于尋找和研究抗腫瘤藥物具有重要價(jià)值。本論文首先1)從高表達(dá)EGFR的乳腺癌細(xì)胞中提取細(xì)胞膜作為TPK來源，用構(gòu)建的GST-C25融合蛋白（包含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和EGFR羧基端自身磷酸化位點(diǎn)的25個(gè)氨基酸）作為反應(yīng)底物，同時(shí)加入EGFR/TPK抑制劑AG1478，采用 Western blot 技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞膜EGFR/TPK活性，以此建立了EGFR/TPK活性測(cè)定方法。測(cè)定結(jié)果表明，從乳腺癌細(xì)胞中提取的細(xì)胞膜EGFR可催化底物GST-C25融合蛋白磷酸化，加入AG1478，底物的磷酸化被抑制。在以Western blot技術(shù)建立的EGFR/TPK活性檢測(cè)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步2)建立了用于高通量篩選（HTS）的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)法（TRFIA）：制備微量的乳腺癌細(xì)胞膜EGFR和配體EGF以及底物GST-C25的微量反應(yīng)體系，并將其加入預(yù)先包被抗GST抗體的微孔板內(nèi)，抗GST抗體與底物GST-C25結(jié)合并固定在微孔板上，再加入銪標(biāo)記抗酪氨酸磷酸化抗體（Eu-antiPY20）使之與GST-C25磷酸化的基團(tuán)特異結(jié)合，洗去多余的抗體，在熒光增強(qiáng)溶液的作用下測(cè)定銪3+(Eu3+ )的熒光強(qiáng)度，以熒光的強(qiáng)弱確定EGFR/TPK活性的高低。結(jié)果顯示，激活的EGFR/TPK 催化底物GST-C25磷酸化，其熒光強(qiáng)度增加，而未激活或加入抑制劑的EGFR/TPK熒光強(qiáng)度減弱，表明EGFR/TPK活性隨熒光強(qiáng)度增加而升高，加入抑制劑后EGFR/TPK活性下降，熒光強(qiáng)度隨之減弱。本論文的最后部分3)利用已經(jīng)建立的高通量篩選 WP=7 模型結(jié)合Western blot技術(shù)對(duì)100余種中藥提取物分別進(jìn)行了初篩和復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種中藥提取物顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的EGFR/TPK活性，這為中藥EGFR/TPK抑制劑的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。與常規(guī)的同位素方法相比，本論文建立的高通量TRFIA篩選模型操作更簡(jiǎn)便和安全，細(xì)胞膜提取物直接作為EGFR激酶來源，使操作成本大大降低，Eu3+以及熒光增強(qiáng)溶液的使用也增加了檢測(cè)的靈敏度，選擇EGFR-羧基端自身磷酸化位點(diǎn)的25個(gè)氨基酸作為底物，增加了TRFIA檢測(cè)的特異性，該方法不僅適用于合成的單體化合物篩選，也適用于中藥以及其它天然來源的粗提取物篩選。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
符號(hào)說明
中文摘要
英文摘要
前 言
第一部分 EGFR/TPK檢測(cè)模型的建立
第二部分 EGFR/TPK高通量篩選模型的建立
第三部分 篩選模型的應(yīng)用
小 結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述一 細(xì)胞周期與抗腫瘤治療展望
綜述二 細(xì)胞周期與腫瘤治療的關(guān)系
論文及綜述發(fā)表情況
致 謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 葛高翔,吳靜,林其誰(shuí);表皮生長(zhǎng)因子受體體外測(cè)活的非同位素方法[J];科學(xué)通報(bào);2000年22期

2 呂根法,李文維,伍津津;銀屑病皮損內(nèi)酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究[J];中華皮膚科雜志;2000年02期

本文編號(hào)：2842384