目的建立全人源單鏈抗體(single-chain antibody fragment,scFv)庫的噬菌體展示技術(shù)。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板,IgG類抗體基因為引物,PCR擴增獲得重鏈可變區(qū)片段(V_H)和輕鏈可變區(qū)片段(V_L),然后以V_H和V_L為模板,經(jīng)重疊PCR獲得scFv,經(jīng)sfiⅠ酶切,插入pComb3xss載體,電轉(zhuǎn)后獲得一定容量的抗體庫;加入輔助噬菌體VCSM13過夜培養(yǎng),上清液經(jīng)PEG-NaCl沉淀,無菌PBS重懸噬菌體沉淀,即完成噬菌體抗體庫的構(gòu)建;采用Phage ELISA法進行噬菌體單克隆抗體的特異性鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建了庫容為2. 6×10~9的噬菌體抗體庫;隨機挑選的100個噬菌體單克隆中共篩選到2個疑似H1N1株HA抗原的噬菌體抗體。結(jié)論成功構(gòu)建了噬菌體抗體庫的技術(shù)平臺,可用于各類功能抗體的篩選。
【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 樣本
    1.2 質(zhì)粒、細(xì)胞及噬菌體
    1.3 主要試劑及儀器
    1.4 引物設(shè)計及合成
    1.5 目的基因片段VH及VL的擴增
    1.6 sc Fv的擴增
    1.7 TA克隆
    1.8 克隆產(chǎn)物的酶切鑒定
    1.9 噬菌體抗體庫的制備
    1.1 0 噬菌體抗體庫的富集篩選
    1.1 1 噬菌體滴度檢測
    1.1 2 噬菌體單克隆抗體特異性鑒定
2 結(jié)果
    2.1 VH和VL擴增產(chǎn)物的鑒定
    2.2 scFv擴增產(chǎn)物的鑒定
    2.3 克隆產(chǎn)物的鑒定
    2.4 噬菌體抗體庫的富集篩選
    2.5 噬菌體單克隆抗體的特異性
3討論

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