目的：研究RNAi(RNA interference)對CSB表達(dá)的抑制作用，構(gòu)建CSB表達(dá)抑制的細(xì)胞模型及探討CSB的生物學(xué)功能。 方法：根據(jù)CSB基因序列及其二級結(jié)構(gòu)特征，依據(jù)Tuschl等設(shè)計(jì)siRNA的原則，確定并合成了針對CSB基因的siRNA，構(gòu)建2個siRNA質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體方法將siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞株，以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的細(xì)胞為對照；細(xì)胞經(jīng)潮霉素篩選后以半定量RT-PCR法及Western blot檢測siRNA的抑制效應(yīng)；通過繪制生長曲線，研究CSB對于細(xì)胞增殖方面的影響；不同UV劑量照射后，通過集落克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)，熒光染色法，研究CSB對于細(xì)胞凋亡方面的影響。 結(jié)果：2組siRNA均可有效抑制CSB基因的表達(dá)，其RT-PCR結(jié)果表明其在轉(zhuǎn)錄水平的抑制分別為44.47％與53.52％，Western blot結(jié)果說明其蛋白表達(dá)亦受到明顯的抑制；細(xì)胞增殖動力學(xué)檢測結(jié)果首次表明，2組CSB-siRNA均可降低HeLa細(xì)胞的增殖速度；其在5J／m~2 UV照射后細(xì)胞存活率分別為29.1±4.5％和44.8±5.7％，顯著低于CN-siRNA對照組60.8±5.0％，P＜0.001，其在10J/m~2 UV照射后細(xì)胞存活率分別為12.0±2.6％和11.5±3.0％，同樣顯著低于CN-siRNA對照組20.6±5.3％，P＜0.001；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染兩組siRNA的HeLa細(xì)胞與與陰性對照相比表現(xiàn)出較高的自發(fā)凋亡率，10J／m~2 UV照射后，轉(zhuǎn)染兩組siRNA的HeLa細(xì)胞的凋亡率與陰性對照相比較均表現(xiàn)出顯著提高(F=12.81，P=0.0032＜0.01)；熒光染色結(jié)果亦說明siRNA可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生并提高其對紫外線(UV)照射的敏感性。 結(jié)論：成功建立siRNA抑制CSB表達(dá)的模型；siRNA抑制CSB表達(dá)后可有效降低HeLa細(xì)胞的增殖速度、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生并提高其對紫外線(UV)照射的敏感性；首次發(fā)現(xiàn)抑制CSB基因表達(dá)能提高細(xì)胞的自發(fā)凋亡率。本研究為深入研究CSB基因功能和開發(fā)其為抗腫瘤靶基因奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：Q786
【部分圖文】：

2.2siRNA對CSB基因表達(dá)的抑制作用2.2.IRT一PCR檢測CSB轉(zhuǎn)錄水平分別提取轉(zhuǎn)染SIRNA的HeLa細(xì)胞總RNA，檢測CSB基因表達(dá)變化。圖6為轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA，CN一SIRNA質(zhì)粒后的各細(xì)胞CSB基因表達(dá)的mRNA的RT一PCR瓊脂糖電泳圖，條帶大小無誤;我們對CSB及ACT困條帶進(jìn)行了灰度定量分析(以ACT則為參照)，見表1，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA質(zhì)�？稍谵D(zhuǎn)錄水平有效抑制CSB表達(dá)，分別降低至陰性對照細(xì)胞的44.47%和53.52%。圖6轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞CSBmRNA的Rr一PCR瓊脂糖電泳圖表1轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞CSBmRNA的RT一PCR電泳條帶的灰度分析51RNACSBACTINCN一5iRNA1566.051154.252一51RNA107一SIRNA624.057731.1141034.221006.84CSB/ACTIN1

分別提取轉(zhuǎn)染siRN.A的HeLa細(xì)胞總蛋白，檢測CSB蛋白表達(dá)變化。圖7為轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞CSB蛋白的W七Stemblot結(jié)果，由此可見:52一SIR封A，107一SIRNA質(zhì)粒可抑制CSB蛋白在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。

為考察轉(zhuǎn)染siRNA后細(xì)胞的增殖情況，我們分別對三組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞繪制生長曲線。表2顯示的是三組siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，依據(jù)表2中的數(shù)據(jù)繪制生長曲線如圖8。由圖8可見，與陰性對照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA質(zhì)粒的細(xì)胞生長速度明顯降低。由此可見CSB可能生長增殖調(diào)控等活動，并在其中發(fā)揮重要的作用。表2SIRNA生長曲線數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理(x104)1OAY2OAY3OAY4DAYSDA丫6OAY7OAYNO.52一1NO.52一2NO.52一3平均值標(biāo)準(zhǔn)差0.5070.8160.5030.6910.5270.8290.5123330.0128580.7786670.0761991.6881.7131.751.7170.0311932.782.852.972.8666670.096093.373.293.23.296667.0702385.335.725.625.5566670.2025679.285102310.19.8716670.512209NO.107一1NO.107一2NO.107一3平均值標(biāo)準(zhǔn)差0.510.7760.5030.840.4930.9520.5()20.8560.0085440.0890841.8371.7381.761.7783330.0519843.272.953.343.1866670.1577784.084.214.134，140.0655746.3256.336.586，4116670.1458021211.6612.5812.080.465188NO.CN一10.491.1012.1633.984.7677.5315.42NO.CN一20.4931.111.8874.054.687.4916.04NO.CN一30.5131.18423.985.28.2316.63平均值0.4986671.1316672.0166674.0437484.8823337.7516.03標(biāo)瞧差二0.012503.0。O斗55斗50.13日7530.040盛巧_一衛(wèi)785斷_0.416173__Q
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 席曉蓉,孫強(qiáng)明,孫茂盛;RNA干擾抗HIV1的基本策略及其優(yōu)化[J];生命的化學(xué);2004年06期

2 燕春艷;RNA干擾技術(shù)研究進(jìn)展[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2003年09期

3 馬鵬鵬,葛曄華,郭睿,馬靜,陳平,薛社普,韓代書;小分子干擾RNA(siRNA)表達(dá)載體沉默靶基因的研究[J];解剖學(xué)報(bào);2004年06期

4 趙洪波,張嘉寧;RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用[J];大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年04期

5 孟和,陳學(xué)輝,潘玉春;RNA干擾用siRNA的體外轉(zhuǎn)錄合成[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版);2004年01期

6 范怡敏,耿飛,吳興中;RNAi的機(jī)制及RNAi技術(shù)的應(yīng)用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2004年04期

7 張琴,趙勝,何凱;RNA干擾的研究現(xiàn)狀與展望[J];黃牛雜志;2004年05期

8 周幼芬,陳建偉,范挽亭,張昊昊,廖繼東,胡海燕;RNA干擾技術(shù)及其應(yīng)用[J];現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志;2004年05期

9 ;RNA干擾研究前沿和應(yīng)用領(lǐng)域[J];生命科學(xué)儀器;2004年02期

10 王菊萍,王瑩,霍艷英,郭藹光,張開泰;基于smad7基因?yàn)榘行蛄械腞NA干涉作用研究[J];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 胡平方;纖溶酶原激活物抑制劑-1 siRNA治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 蔡磊;攜帶Survivin特異性siRNA的完全人源性肝癌單鏈抗體/魚精蛋白截短體融合蛋白對肝癌凋亡的影響研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 張偉;H5N1亞型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制劑的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

4 郭炬;siRNA靶向沉默HPA基因?qū)θ税螂装〣IU-87細(xì)胞的生物學(xué)及HPA相關(guān)基因的影響[D];華中科技大學(xué);2011年

5 徐向上;Aptamer-protamine-siRNA復(fù)合物在腫瘤靶向治療中的作用研究[D];華中科技大學(xué);2010年

6 韓璐;豆科植物蒺藜苜蓿發(fā)育相關(guān)基因[D];山東大學(xué);2010年

7 王哲文;后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2006年

8 向飛宇;心衰的機(jī)制與干細(xì)胞治療基礎(chǔ)研究[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

9 張彥萍;纖溶酶原激活物抑制劑-1siRNA抗博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化作用及機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

10 萬黎;Galectin-3特異性siRNA對肺癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究[D];華中科技大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉峰;Ⅰ.siRNA抑制CSB基因表達(dá)及對細(xì)胞增殖和輻射敏感性的影響 　Ⅱ.α粒子誘發(fā)癌變細(xì)胞中p14和p16基因甲基化及表達(dá)變化[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

2 鄭亞婷;應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制銅綠假單胞菌外膜蛋白OprM表達(dá)的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

3 賈麗潔;ICP27特異性siRNA抑制HSV-1病毒復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2010年

4 付振宇;siRNA沉默HIF-1α基因?qū)θ饲傲邢侔㏄C3細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響[D];蘇州大學(xué);2010年

5 韋德芳;利用pSOS-HUS系統(tǒng)篩選靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

6 馬婧薇;ASGPR介導(dǎo)的靶向siRNA抑制HBV的復(fù)制與表達(dá)[D];華中科技大學(xué);2009年

7 方首镕;siRNA干擾MDR1逆轉(zhuǎn)舌癌耐藥性表型的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

8 李杰;抑制PKM2的siRNA協(xié)同抑制CCND1的作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

9 王涵;應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)Survivin抑制鼻咽癌細(xì)胞生長的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

10 索濤莉;靶向Hsp90β siRNA對Jurkat細(xì)胞生長抑制及化療敏感性影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

本文編號：2835389