目的：研究RNAi(RNA interference)對CSB表達的抑制作用，構建CSB表達抑制的細胞模型及探討CSB的生物學功能。 方法：根據(jù)CSB基因序列及其二級結構特征，依據(jù)Tuschl等設計siRNA的原則，確定并合成了針對CSB基因的siRNA，構建2個siRNA質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體方法將siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細胞株，以轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒的細胞為對照；細胞經(jīng)潮霉素篩選后以半定量RT-PCR法及Western blot檢測siRNA的抑制效應；通過繪制生長曲線，研究CSB對于細胞增殖方面的影響；不同UV劑量照射后，通過集落克隆形成率，流式細胞術，熒光染色法，研究CSB對于細胞凋亡方面的影響。 結果：2組siRNA均可有效抑制CSB基因的表達，其RT-PCR結果表明其在轉(zhuǎn)錄水平的抑制分別為44.47％與53.52％，Western blot結果說明其蛋白表達亦受到明顯的抑制；細胞增殖動力學檢測結果首次表明，2組CSB-siRNA均可降低HeLa細胞的增殖速度；其在5J／m~2 UV照射后細胞存活率分別為29.1±4.5％和44.8±5.7％，顯著低于CN-siRNA對照組60.8±5.0％，P＜0.001，其在10J/m~2 UV照射后細胞存活率分別為12.0±2.6％和11.5±3.0％，同樣顯著低于CN-siRNA對照組20.6±5.3％，P＜0.001；流式細胞術結果表明，轉(zhuǎn)染兩組siRNA的HeLa細胞與與陰性對照相比表現(xiàn)出較高的自發(fā)凋亡率，10J／m~2 UV照射后，轉(zhuǎn)染兩組siRNA的HeLa細胞的凋亡率與陰性對照相比較均表現(xiàn)出顯著提高(F=12.81，P=0.0032＜0.01)；熒光染色結果亦說明siRNA可促進細胞凋亡的發(fā)生并提高其對紫外線(UV)照射的敏感性。 結論：成功建立siRNA抑制CSB表達的模型；siRNA抑制CSB表達后可有效降低HeLa細胞的增殖速度、促進細胞凋亡的發(fā)生并提高其對紫外線(UV)照射的敏感性；首次發(fā)現(xiàn)抑制CSB基因表達能提高細胞的自發(fā)凋亡率。本研究為深入研究CSB基因功能和開發(fā)其為抗腫瘤靶基因奠定了基礎。
【學位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：Q786
【部分圖文】：

2.2siRNA對CSB基因表達的抑制作用2.2.IRT一PCR檢測CSB轉(zhuǎn)錄水平分別提取轉(zhuǎn)染SIRNA的HeLa細胞總RNA，檢測CSB基因表達變化。圖6為轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA，CN一SIRNA質(zhì)粒后的各細胞CSB基因表達的mRNA的RT一PCR瓊脂糖電泳圖，條帶大小無誤;我們對CSB及ACT困條帶進行了灰度定量分析(以ACT則為參照)，見表1，結果顯示:轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA質(zhì)�？稍谵D(zhuǎn)錄水平有效抑制CSB表達，分別降低至陰性對照細胞的44.47%和53.52%。圖6轉(zhuǎn)染后的三組細胞CSBmRNA的Rr一PCR瓊脂糖電泳圖表1轉(zhuǎn)染后的三組細胞CSBmRNA的RT一PCR電泳條帶的灰度分析51RNACSBACTINCN一5iRNA1566.051154.252一51RNA107一SIRNA624.057731.1141034.221006.84CSB/ACTIN1

分別提取轉(zhuǎn)染siRN.A的HeLa細胞總蛋白，檢測CSB蛋白表達變化。圖7為轉(zhuǎn)染后的三組細胞CSB蛋白的W七Stemblot結果，由此可見:52一SIR封A，107一SIRNA質(zhì)�？梢种艭SB蛋白在HeLa細胞中的表達。

為考察轉(zhuǎn)染siRNA后細胞的增殖情況，我們分別對三組轉(zhuǎn)染后的HeLa細胞繪制生長曲線。表2顯示的是三組siRNA轉(zhuǎn)染后細胞的增殖情況的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，依據(jù)表2中的數(shù)據(jù)繪制生長曲線如圖8。由圖8可見，與陰性對照細胞相比，轉(zhuǎn)染52一SIRNA，107一SIRNA質(zhì)粒的細胞生長速度明顯降低。由此可見CSB可能生長增殖調(diào)控等活動，并在其中發(fā)揮重要的作用。表2SIRNA生長曲線數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理(x104)1OAY2OAY3OAY4DAYSDA丫6OAY7OAYNO.52一1NO.52一2NO.52一3平均值標準差0.5070.8160.5030.6910.5270.8290.5123330.0128580.7786670.0761991.6881.7131.751.7170.0311932.782.852.972.8666670.096093.373.293.23.296667.0702385.335.725.625.5566670.2025679.285102310.19.8716670.512209NO.107一1NO.107一2NO.107一3平均值標準差0.510.7760.5030.840.4930.9520.5()20.8560.0085440.0890841.8371.7381.761.7783330.0519843.272.953.343.1866670.1577784.084.214.134，140.0655746.3256.336.586，4116670.1458021211.6612.5812.080.465188NO.CN一10.491.1012.1633.984.7677.5315.42NO.CN一20.4931.111.8874.054.687.4916.04NO.CN一30.5131.18423.985.28.2316.63平均值0.4986671.1316672.0166674.0437484.8823337.7516.03標瞧差二0.012503.0。O斗55斗50.13日7530.040盛巧_一衛(wèi)785斷_0.416173__Q
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本文編號：2835389