目的：脊髓損傷是常見疾患，造成許多病人肢體功能的障礙。嗅鞘細(xì)胞(OECs)兼有雪旺氏細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞的雙重功能特點(diǎn)，它能伴從PNS進(jìn)入CNS而不同于雪旺氏細(xì)胞僅局限于PNS中，克服雪旺氏細(xì)胞與成纖維細(xì)胞在脊髓移植中功能的不足；嗅鞘細(xì)胞能在損傷段為再生神經(jīng)纖維形成髓鞘，保護(hù)其不受局部抑制因子的影響；嗅鞘細(xì)胞尚可分泌多種神經(jīng)生長因子。OECs移植治療脊髓損傷的具有良好的前景。但由于OECs本身表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平較低，尚不能滿足軸突再生的需要，實(shí)驗(yàn)中在損傷稍遠(yuǎn)處觀察到再生軸突的數(shù)量仍較少。NT-3是NTs家族眾多的成員中最有效的一種，其對軸突再生的促進(jìn)效果優(yōu)于NGF和BDNF。但由于外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子不能通過血腦屏障，半衰期短，臨床應(yīng)用上尚缺乏安全有效的給藥途徑。本研究的目的是利用基因工程技術(shù)從大鼠基因組中擴(kuò)增出NT-3基因，構(gòu)建出真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入OECs中，探討其在OECs中的表達(dá)，有望使其更好地發(fā)揮其促進(jìn)再生的能力。 方法：從大鼠肝細(xì)胞中提取出大鼠基因組DNA，通過PCR方法進(jìn)行NT-3的基因擴(kuò)增，進(jìn)行酶切后插入真核表達(dá)載體PcDNA3.1(+)，經(jīng)基因序列分析，篩選正確的克隆，應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其導(dǎo)入體外培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞，采用RT-PCR、Westem blot、ELISA等方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的檢測。最后，將轉(zhuǎn)染后的嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)上清加入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察分泌蛋白的生物學(xué)活性。 結(jié)果：采用二次PCR的方法從基因組中擴(kuò)增出了NT-3全長cdS， 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院碩士畢業(yè)論文 酶切后插入真核表達(dá)載體PcDNA3.1(+)，重組克隆經(jīng)酶切鑒定正確， 序列測定結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致。轉(zhuǎn)染OECs后可檢測到NT3mRNA的表 達(dá)量的增加，OECs細(xì)胞裂解液應(yīng)用Western Blot方法培養(yǎng)、上清采 用E L 1 SA方法可檢測到NT一3蛋白的表達(dá)，同時，此上清對神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞的存活與突起生長具促進(jìn)作用。 結(jié)論:由于OECs相對于雪旺氏細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的諸多潛在優(yōu) 勢，是脊髓損傷基因治療較好的受體細(xì)胞。重組PcDNA3.1(+)一NT3 載體可對體外培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)月色進(jìn)行轉(zhuǎn)染，可增加NT一3蛋白表達(dá)分泌 量，且分泌的NT--3蛋白具生物學(xué)活性，為基因幣封乍嗅鞘細(xì)胞在脊髓 損傷治療的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
1 縮寫詞
2 中文摘要
3 英文摘要
4 前言
5 實(shí)驗(yàn)部分
    5.1 大鼠NT-3基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
    材料和方法
        結(jié)果
        討論
參考文獻(xiàn)
    5.2 NT-3基因轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞與表達(dá)檢測
        材料和方法
        結(jié)果
        討論
    參考文獻(xiàn)
6 小結(jié)
7 論文照片
8 文獻(xiàn)綜述
9 參考文獻(xiàn)
10 致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2832275