前言 以DNA重組技術為核心發(fā)展起來的分子生物學技術，是人們認識生命本質的有利工具，已經滲透到工、農、醫(yī)等各行業(yè)為各行業(yè)的發(fā)展做出無法估量的貢獻。基因治療已成為醫(yī)學各學科研究疾病治療的新途徑和熱點。1型糖尿病以單一一種蛋白質--胰島素缺乏為特點，無疑成為基因治療的理想疾病。 糖尿病的基因治療國內外很多實驗已經在糖尿病動物模型內嘗試，基因治療目前急待解決的問題是胰島素的合理調控分泌和安全有效的載體導入系統(tǒng)。 本實驗在前人的基礎上，在突變的胰島素原基因的上游連接二個調控元件：肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因啟動子中的葡萄糖反應元件(GLRE)和胰島素生長因子結合蛋白-1(IGFBP-1)基因啟動子胰島素反應序列，并轉導入逆轉錄病毒載體。預想籍此轉入鼠肝細胞完成胰島素受血糖刺激和自身反饋抑制的理想分泌，從而為糖尿病基因治療的進展并最終應用與臨床做基礎性的鋪墊。 實驗材料與方法 1．Mini Best plasmid Purification Kit提取質粒pLXSN-INS，pMD18-T-INS并鑒定。 2．測序鑒定pUC-GI質粒。 3．對突變的胰島素原基因、胰島素生長因子結合蛋白-1基因(IGFBP-1)、丙酮酸羧激酶基因(L-PK)進行限制性酶圖譜分析。選擇合適的限制性內切酶位點進行基因重組。 4．重組突變人胰島素原基因：在其上游重組調控分泌元件 (1)．XbaⅠ限制性內切酶切pMD18-T-INS質粒，3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，電泳切膠回收418bp條帶。 (2)．SphⅠ限制性內切酶切pUC-GI質粒3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次 酶切，電泳切膠回收3740bp條帶。 (3).連接上述兩步驟產物。 (4).連接產物全量轉人感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取純化。 (5).鑒定重組質粒pUC一Gn。 5.構建含調控元件的突變人胰島素原基因的逆轉錄病毒重組質粒。 (1).限制性內切酶Hindln酶切pUC一Gll質粒，產物乙醇精制后3’平 滑，5’磷酸化;限制性內切酶Ec0RI再次酶切，電泳切膠回收1008坤條帶。 (2).限制性內切酶BalnHI酶切pLXSN一INS質粒，產物乙醇精制后3’ 平滑，5’磷酸化;Ec0RI再次酶切，酶切產物全部上樣電泳膠回收59加坤條 帶。 (3).連接上述兩步驟產物. (4).轉化感受態(tài)細胞JM 109，涂板過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆并提取純 化。 (5).PCR及酶切方法鑒定重組質粒pl盆SN一Gll。 實驗結果 1.突變的胰島素原基因、胰島素生長因子結合蛋白一1基因(IGFBP- 1)、丙酮酸梭激酶基因(L一PK)進行限制性酶圖譜分析結果見圖9。 2.限制性內切酶Xbal，sall分別對應在T載體的T一A克隆位點 EeoRV兩側，兩酶切pMD18一T一INS后，切下約2690bp的載體片段及約 418bp左右的突變胰島素原基因片段。切膠回收突變胰島素原基因片段電 泳結果見圖1。 3.限制性內切酶印hI，S欲I雙酶切pUC一GI質粒后，膠回收3740bP條 帶電泳結果見圖2。 4.分別應用限制性酶切及PCR兩種方法鑒定重組質粒pUC一Gll。電 泳結果分別見圖3，圖4。 5.重組質粒pUC一Gll插人片段的上游多克隆位點含有Ec0IU限制性 酶切位點，下游含有Hindln酶切位點。雙酶切后回收loosbP的目的DNA 片段，電泳結果見圖5。 6.pLXSN一INS質粒的突變胰島素原基因插入在載體的多克隆位點的 Ec0RI及BamHI兩限制性酶切位點之間。BamHFEco班雙酶切下的載體片 段電泳結果見圖6。 7.選擇合適的限制性內切酶鑒定重組質粒pLXSN一Gll，結果見圖7。 應用多聚酶鏈式反應進一步鑒定重組質粒結果見圖8。 討論 近年來，利用基因工程建立和分泌胰島素的細胞系治療糖尿病已經引 起科研工作者的極大興趣，并取得了可喜的進步。但糖尿病的基因治療又 面臨著巨大的挑戰(zhàn)，其中之一就是采取何種策略將胰島素的水平限制在一 個非常狹窄的生理范圍內，否則，若將基因工程改造后的p細胞應用于人 體內，會因為細胞釋放過多的胰島素引起低血糖，甚至嚴重致死。一些來源 于真核細胞的啟動子曾經嘗試調控基因的表達，啟動轉錄的物質為類固醇 激素、氧氣、重金屬、或物理刺激(如放射線等)。然而這些啟動子并不適用 于應用臨床治療。 本實驗選取胰島素生長因子結合蛋白一1基因調節(jié)區(qū)及丙酮酸梭激酶 基因的葡萄糖反應元件區(qū)作為基因調節(jié)序列，突變人胰島素原基因與兩段 順式調控元件(胰島素生長因子結合蛋白一1基因調節(jié)區(qū)及丙酮酸梭激酶 基因的葡萄糖反應元件區(qū))重組，通過肝臟細胞特異的反式調控因子即轉 錄因子即可實現細胞特異的調控表達。此種調控感受機體生理濃度葡萄糖 及胰島素的刺激，實現按生理需要調控胰島素分泌。為糖尿病最終應用于 臨床奠定了堅實的基礎。 把外源基因轉人靶細胞的技術主要有:化學物理方法:DNA與一磷酸鈣 共沉淀法，脂質體包埋法，脂質體細胞融合法，顯微注射法，電穿孔法;病毒 載體的方法:RNA病毒和DNA病毒載體等。本實驗采用了逆轉錄病毒載 體轉染法，其介導的基因轉移具有高效轉移，高整合，高表達和宿主細胞范 圍廣的優(yōu)點，是常用的基因轉移系統(tǒng)，其感染
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346

【共引文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 張建民;阿爾茨海默病早期診斷生物標志和基因重組疫苗的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2003年

2 馮登敏;Rep蛋白介導的定點整合系統(tǒng)順式元件研究及應用[D];復旦大學;2006年

本文編號：2819942