前言 以DNA重組技術(shù)為核心發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，是人們認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)的有利工具，已經(jīng)滲透到工、農(nóng)、醫(yī)等各行業(yè)為各行業(yè)的發(fā)展做出無法估量的貢獻(xiàn)�；蛑委熞殉蔀獒t(yī)學(xué)各學(xué)科研究疾病治療的新途徑和熱點(diǎn)。1型糖尿病以單一一種蛋白質(zhì)--胰島素缺乏為特點(diǎn)，無疑成為基因治療的理想疾病。 糖尿病的基因治療國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在糖尿病動(dòng)物模型內(nèi)嘗試，基因治療目前急待解決的問題是胰島素的合理調(diào)控分泌和安全有效的載體導(dǎo)入系統(tǒng)。 本實(shí)驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上，在突變的胰島素原基因的上游連接二個(gè)調(diào)控元件：肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因啟動(dòng)子中的葡萄糖反應(yīng)元件(GLRE)和胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1(IGFBP-1)基因啟動(dòng)子胰島素反應(yīng)序列，并轉(zhuǎn)導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。預(yù)想籍此轉(zhuǎn)入鼠肝細(xì)胞完成胰島素受血糖刺激和自身反饋抑制的理想分泌，從而為糖尿病基因治療的進(jìn)展并最終應(yīng)用與臨床做基礎(chǔ)性的鋪墊。 實(shí)驗(yàn)材料與方法 1．Mini Best plasmid Purification Kit提取質(zhì)粒pLXSN-INS，pMD18-T-INS并鑒定。 2．測(cè)序鑒定pUC-GI質(zhì)粒。 3．對(duì)突變的胰島素原基因、胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-1基因(IGFBP-1)、丙酮酸羧激酶基因(L-PK)進(jìn)行限制性酶圖譜分析。選擇合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)進(jìn)行基因重組。 4．重組突變?nèi)艘葝u素原基因：在其上游重組調(diào)控分泌元件 (1)．XbaⅠ限制性內(nèi)切酶切pMD18-T-INS質(zhì)粒，3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，電泳切膠回收418bp條帶。 (2)．SphⅠ限制性內(nèi)切酶切pUC-GI質(zhì)粒3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次 酶切，電泳切膠回收3740bp條帶。 (3).連接上述兩步驟產(chǎn)物。 (4).連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)人感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提取純化。 (5).鑒定重組質(zhì)粒pUC一Gn。 5.構(gòu)建含調(diào)控元件的突變?nèi)艘葝u素原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒。 (1).限制性內(nèi)切酶Hindln酶切pUC一Gll質(zhì)粒，產(chǎn)物乙醇精制后3’平 滑，5’磷酸化;限制性內(nèi)切酶Ec0RI再次酶切，電泳切膠回收1008坤條帶。 (2).限制性內(nèi)切酶BalnHI酶切pLXSN一INS質(zhì)粒，產(chǎn)物乙醇精制后3’ 平滑，5’磷酸化;Ec0RI再次酶切，酶切產(chǎn)物全部上樣電泳膠回收59加坤條 帶。 (3).連接上述兩步驟產(chǎn)物. (4).轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM 109，涂板過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆并提取純 化。 (5).PCR及酶切方法鑒定重組質(zhì)粒pl盆SN一Gll。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.突變的胰島素原基因、胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白一1基因(IGFBP- 1)、丙酮酸梭激酶基因(L一PK)進(jìn)行限制性酶圖譜分析結(jié)果見圖9。 2.限制性內(nèi)切酶Xbal，sall分別對(duì)應(yīng)在T載體的T一A克隆位點(diǎn) EeoRV兩側(cè)，兩酶切pMD18一T一INS后，切下約2690bp的載體片段及約 418bp左右的突變胰島素原基因片段。切膠回收突變胰島素原基因片段電 泳結(jié)果見圖1。 3.限制性內(nèi)切酶印hI，S欲I雙酶切pUC一GI質(zhì)粒后，膠回收3740bP條 帶電泳結(jié)果見圖2。 4.分別應(yīng)用限制性酶切及PCR兩種方法鑒定重組質(zhì)粒pUC一Gll。電 泳結(jié)果分別見圖3，圖4。 5.重組質(zhì)粒pUC一Gll插人片段的上游多克隆位點(diǎn)含有Ec0IU限制性 酶切位點(diǎn)，下游含有Hindln酶切位點(diǎn)。雙酶切后回收loosbP的目的DNA 片段，電泳結(jié)果見圖5。 6.pLXSN一INS質(zhì)粒的突變胰島素原基因插入在載體的多克隆位點(diǎn)的 Ec0RI及BamHI兩限制性酶切位點(diǎn)之間。BamHFEco班雙酶切下的載體片 段電泳結(jié)果見圖6。 7.選擇合適的限制性內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒pLXSN一Gll，結(jié)果見圖7。 應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒結(jié)果見圖8。 討論 近年來，利用基因工程建立和分泌胰島素的細(xì)胞系治療糖尿病已經(jīng)引 起科研工作者的極大興趣，并取得了可喜的進(jìn)步。但糖尿病的基因治療又 面臨著巨大的挑戰(zhàn)，其中之一就是采取何種策略將胰島素的水平限制在一 個(gè)非常狹窄的生理范圍內(nèi)，否則，若將基因工程改造后的p細(xì)胞應(yīng)用于人 體內(nèi)，會(huì)因?yàn)榧?xì)胞釋放過多的胰島素引起低血糖，甚至嚴(yán)重致死。一些來源 于真核細(xì)胞的啟動(dòng)子曾經(jīng)嘗試調(diào)控基因的表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)為類固醇 激素、氧氣、重金屬、或物理刺激(如放射線等)。然而這些啟動(dòng)子并不適用 于應(yīng)用臨床治療。 本實(shí)驗(yàn)選取胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白一1基因調(diào)節(jié)區(qū)及丙酮酸梭激酶 基因的葡萄糖反應(yīng)元件區(qū)作為基因調(diào)節(jié)序列，突變?nèi)艘葝u素原基因與兩段 順式調(diào)控元件(胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白一1基因調(diào)節(jié)區(qū)及丙酮酸梭激酶 基因的葡萄糖反應(yīng)元件區(qū))重組，通過肝臟細(xì)胞特異的反式調(diào)控因子即轉(zhuǎn) 錄因子即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異的調(diào)控表達(dá)。此種調(diào)控感受機(jī)體生理濃度葡萄糖 及胰島素的刺激，實(shí)現(xiàn)按生理需要調(diào)控胰島素分泌。為糖尿病最終應(yīng)用于 臨床奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 把外源基因轉(zhuǎn)人靶細(xì)胞的技術(shù)主要有:化學(xué)物理方法:DNA與一磷酸鈣 共沉淀法，脂質(zhì)體包埋法，脂質(zhì)體細(xì)胞融合法，顯微注射法，電穿孔法;病毒 載體的方法:RNA病毒和DNA病毒載體等。本實(shí)驗(yàn)采用了逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體轉(zhuǎn)染法，其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移具有高效轉(zhuǎn)移，高整合，高表達(dá)和宿主細(xì)胞范 圍廣的優(yōu)點(diǎn)，是常用的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其感染
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張建民;阿爾茨海默病早期診斷生物標(biāo)志和基因重組疫苗的研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

2 馮登敏;Rep蛋白介導(dǎo)的定點(diǎn)整合系統(tǒng)順式元件研究及應(yīng)用[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2819942