N-甲基-D-門冬氨酸受體(NMDAR,NR)的過度激活與腦血管疾病、腦外傷、腦腫瘤及其繼發(fā)的腦內(nèi)綜合征(如腦心綜合征、消化道出血等)、焦慮、抑郁、疼痛、癲癇、癡呆等重大神經(jīng)、精神疾患密切相關(guān)。如果能及時、有效地選擇性干預(yù)局部受累腦區(qū)NR過度激活所介導(dǎo)的神經(jīng)興奮毒性,將為上述疾患提供有效的防治手段。但已有的NR干預(yù)藥物因嚴(yán)重的毒副作用和難以適時使用而不能進(jìn)入臨床,興奮毒性腦損害防治策略研究急需取得新的突破。安全、有效的保護(hù)性疫苗接種和抗體治療在該領(lǐng)域是一種新的探索。本實(shí)驗(yàn)主要針對人NR主亞基NR1a膜蛋白M3-M4環(huán)B細(xì)胞表位(NE1)的八分枝抗原肽(multiple antigen peptides, MAPsNR1a)的免疫接種途徑進(jìn)行比較研究,并以MAPsNR1a為篩選抗原淘篩人源性噬菌體抗體庫,為興奮毒性腦損害疫苗免疫防治策略的建立提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下: 一. MAPsNR1a的設(shè)計(jì)、合成和小鼠免疫接種途徑研究 本實(shí)驗(yàn)組已得到人NR1a膜蛋白M3-M4環(huán)上一個B表位NE1,固相合成法合成MAPsNR1a,并以MAPsNR1a為免疫原對小鼠進(jìn)行鼻腔、腹腔、皮下等多途徑免疫接種并檢測MAPsNR1a特異性抗體;對小鼠進(jìn)行多指標(biāo)行為學(xué)觀察、水迷宮、避暗、跳臺等實(shí)驗(yàn)及鼻粘膜HE染色,評估MAPsNR1a免疫的安全性和有效性。 結(jié)果提示,皮下和腹腔免疫接種均檢測到MAPsNR1a特異性抗體,且對小鼠的行為、學(xué)習(xí)記憶能力沒有影響,此兩種途徑安全、有效,可以作為MAPsNR1a抗興奮毒性腦保護(hù)疫苗的接種途徑;鼻腔免疫接種未檢測到相應(yīng)抗體,但鑒于其應(yīng)用簡便等優(yōu)點(diǎn),可通過佐劑交聯(lián)、改變MAPsNR1a的溶解狀態(tài)等方法進(jìn)行進(jìn)一 WP=5 步研究。 二. NE1特異性人源性單鏈抗體噬菌體的篩選和鑒定 NE1單克隆抗體具有抗興奮毒性保護(hù)效應(yīng),如果能大量制備NE1單克隆抗體,對患病人群在有發(fā)病征兆或發(fā)病早期即給予保護(hù)性抗體,不失為一種可行、有效的保護(hù)措施。但單克隆抗體不僅制備成本昂貴,而且多為鼠源性,其Fc段是引起人體排異反應(yīng)的主要部分,即使人源化也會介導(dǎo)抗體依賴的補(bǔ)體激活效應(yīng)。噬菌體抗體庫技術(shù)用細(xì)菌克隆取代B細(xì)胞克隆表達(dá)抗體,不經(jīng)細(xì)胞融合,甚至不經(jīng)免疫,制備針對任何抗原的抗體分子,在生物技術(shù)領(lǐng)域中,尤其是人源性特異抗體的篩選和制備上獨(dú)具優(yōu)勢。該技術(shù)自90年代初出現(xiàn)以來, 在多種疾病的診斷、治療及機(jī)制研究中顯示出巨大的潛能和廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)利用親和富集篩選的辦法,以MAPsNR1a為篩選抗原淘篩人源性噬菌體重鏈抗體庫和輕鏈抗體庫,各獲得一個有較高結(jié)合活性的陽性克隆。通過基因重組,將重鏈可變區(qū)基因(VH)克隆入輕鏈?zhǔn)删w載體中,獲得了MAPsNR1a特異性單鏈抗體噬菌體克隆。初步鑒定顯示其與MAPsNR1a有高度結(jié)合活性,為下一步MAPsNR1a特異性抗體的生物學(xué)功能研究及制備提供了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392.1

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本文編號：2810281