登革病毒(dengue virus,DV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū),主要引起DF和DHF。DHF的主要特點(diǎn)是血漿滲漏,提示血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)出現(xiàn)了功能障礙。同時(shí)免疫熒光和滴度測(cè)試證明,登革病毒能夠在VEC中增殖。因此,我們認(rèn)為VEC既是DHF患者發(fā)生休克的效應(yīng)細(xì)胞,也是登革病毒在體內(nèi)增殖的靶細(xì)胞之一。 研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞骨架微絲能夠介導(dǎo)VEC的功能和形態(tài)變化。微絲又稱肌動(dòng)蛋白纖維(fibrous-actin,F-actin),由球形肌動(dòng)蛋白(global-actin,G-actin)首尾相連而成,是有極性的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。它們一般以成束或成網(wǎng)的形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi),構(gòu)成所謂的細(xì)胞皮質(zhì)區(qū),調(diào)控細(xì)胞的形狀、表面突起和運(yùn)動(dòng)等。當(dāng)受到某些細(xì)菌或病毒的感染時(shí),微絲能解聚并形成新的結(jié)構(gòu),參與進(jìn)入、胞內(nèi)運(yùn)輸及釋放。微絲研究中最常用的藥物有2類:一類與微絲的正端結(jié)合,起抑制G-actin聚合的作用,如細(xì)胞松弛素(cytochalasin,cyto),Lat A;另一類與微絲的側(cè)基結(jié)合,貫穿微絲的生長(zhǎng),起穩(wěn)定F-actin和對(duì)抑制解聚的作用,如鬼筆環(huán)肽(phalloidin),jasplakinolide(jas)。本研究主要以來(lái)自胎兒臍靜脈的VEC樣細(xì)胞株ECV304為對(duì)象,以登革II型病毒(DEN-2)為感染材料, 應(yīng)用干擾微絲骨架功能的藥物 jas 和 cyto D,探討登革病毒感染與該細(xì)胞相互作用過(guò)程中的分子機(jī)制--微絲骨架的作用,期望能從不同的角度分析細(xì)胞微絲骨架在登革病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下: 1. 登革病毒感染引起ECV304和HUVEC細(xì)胞微絲骨架的解離聚合: 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)2組,即一般感染組與正常對(duì)照組。在正常ECV304細(xì)胞中,F-actin主要以應(yīng)力纖維(stress fiber)的形式存在,廣泛分布于細(xì)胞內(nèi),包括細(xì)胞邊緣部分。以MOI=10對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染,感染5分鐘內(nèi),細(xì)胞微絲出現(xiàn)了解聚;感染10分鐘,微絲解聚的程度進(jìn)一步擴(kuò)大,較多的短 F-actin積聚形成團(tuán)塊;感染后30分鐘,微絲 本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 30170848和30300303資助 WP=9 幾乎完全解聚,部分F-actin 呈大小不一、數(shù)量不等的環(huán)/點(diǎn)狀;感染1小時(shí)后,部分微絲束開(kāi)始恢復(fù),主要分布在細(xì)胞膜下;感染24、48、72和120小時(shí)后,由于病毒大量復(fù)制、病毒蛋白堆積,能夠再次引起長(zhǎng)F-actin的全面解聚;其中有些細(xì)胞內(nèi)形成了特殊的短F-actin結(jié)構(gòu),與病毒蛋白的分布緊密相伴,形態(tài)類似文獻(xiàn)所報(bào)告的肌動(dòng)蛋白尾 (actin tail) 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在登革病毒感染的不同階段,ECV304細(xì)胞的微絲骨架能夠出現(xiàn)一定程度的解聚和排列變化。這提示微絲骨架可能參與了病毒與ECV304細(xì)胞的相互作用,同時(shí)微絲的變化可能是登革病毒感染后血管內(nèi)皮細(xì)胞功能變化的原因之一。 免疫熒光雙染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),微絲解聚與否和細(xì)胞核周登革病毒抗原的堆積沒(méi)有必然的聯(lián)系。在某些病毒抗原陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi),微絲骨架仍然十分完整。在出現(xiàn)微絲解聚的細(xì)胞中,病毒蛋白大都呈現(xiàn)“火焰狀”分布,提示微絲解聚與病毒蛋白合成后期的運(yùn)輸或組裝有關(guān)。 2. 微絲骨架干擾藥物抑制了登革病毒在ECV304細(xì)胞內(nèi)的增殖幅度 本實(shí)驗(yàn)(MOI=10)共設(shè)置了3組:一般感染組、jas高濃度組(1μmol/L)和 cyto高濃度組(1ng/L)。2種藥物在病毒吸附之后立即添加在培養(yǎng)基中,維持5天。在沒(méi)有藥物作用的情況下,病毒滴度在感染后第2天即顯著增加,在第3天達(dá)到峰值,隨后逐漸下降。兩個(gè)藥物組中的病毒滴度也在第3天達(dá)到最高,變化趨勢(shì)與一般感染組基本一致,但數(shù)量較之降低了約35%。這提示jas 和 cyto D能夠干擾登革病毒的增殖。隨后,我們針對(duì)病毒增殖周期的不同環(huán)節(jié),進(jìn)一步開(kāi)展了下面的藥物干擾實(shí)驗(yàn)。 3. 微絲骨架干擾藥物抑制了登革病毒進(jìn)入ECV304細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)(MOI=0.01)共設(shè)置了5組:一般感染組、jas高濃度組(1μmol/L)、jas低濃度組(0.1μmol/L)、 cyto高濃度組(1ng/L)和cyto低濃度組(0.1ng/L)。預(yù)先用不同濃度的jas和cyto D處理vero細(xì)胞1小時(shí),再用登革病毒感染。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物對(duì)登革病毒的感染率都有抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系。其中jas的作用更顯著,jas高濃度組的感染率為一般感染組的57%,而jas低濃度組約為70%左右。 4. 微絲骨架干擾藥物降低了子代登革病毒從ECV304細(xì)胞中釋放的數(shù)量 本實(shí)驗(yàn)(MOI=10)共設(shè)置了3組:一般感染組、jas低濃度組(0.1μmol/L)和 cyto WP=10 低濃度組(0.1ng/L)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們認(rèn)為感染后6～8小時(shí)是登革病毒從ECV304細(xì)胞釋放的關(guān)鍵時(shí)段,于是在感染后4小時(shí)和6小時(shí)施加兩種藥物,作用2小時(shí)后分別收集培養(yǎng)上清,檢測(cè)病毒滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后第6小時(shí)和第8小時(shí),兩藥物組上清中的病毒滴度均顯著低于一般感染組,約為其50%左右。同時(shí),我們收集并檢測(cè)了感染后8小時(shí)的細(xì)胞內(nèi)的病毒滴度,發(fā)現(xiàn)2藥物組的細(xì)胞內(nèi)病毒滴度也呈下降趨勢(shì),約為一般感染組的40～50%。這說(shuō)明jas和cyto D并非單純抑制了病毒的釋放,而可能影響了病毒復(fù)制、病毒蛋白的合成組裝與釋放等多個(gè)環(huán)節(jié),進(jìn)而減少了釋放出胞的子代病毒數(shù)量。 5. 登革病毒感染增加了ECV304細(xì)胞的通透性 transwell細(xì)胞模型能夠部分模擬血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的功能,適于分析某種因素單獨(dú)或多種因素聯(lián)合對(duì)細(xì)胞屏障功能的影響。雖然無(wú)法完全重建體內(nèi)血管的構(gòu)造,但是在沒(méi)有合適的DHF動(dòng)物模型之前,它仍然不失為研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞通透性的有利工具之一。本實(shí)
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R373
【部分圖文】：

登革病毋感染后，HUVEC微絲骨架的改變.(材米受感染的正常細(xì)胞

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王嘉麗;微絲骨架在DENV2感染過(guò)程中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 宋富強(qiáng);RhoA分子在登革2型病毒感染過(guò)程中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 陳煒;微管骨架在登革病毒感染中作用的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2005年

3 李東英;登革Ⅱ型病毒E蛋白基因原核及真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建[D];鄭州大學(xué);2006年

4 雷震;山羊痘病毒“GTPV_gp024”基因區(qū)插入外源基因的表達(dá)研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2809962