【摘要】：T、B淋巴細(xì)胞在機體免疫應(yīng)答過程中需要兩種信號的協(xié)同作用。第一信號為抗原與T細(xì)胞受體TCR的結(jié)合，第二信號為抗原遞呈細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子與T、B淋巴細(xì)胞上的受體結(jié)合。PD-1為T、B淋巴細(xì)胞表面受體，屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量約為50～55kD。在T、B細(xì)胞抗原受體激發(fā)后呈誘導(dǎo)性表達(dá)，也可表達(dá)于活化后的T、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和髓系細(xì)胞，在胸腺及骨髓發(fā)育的特定階段也可表達(dá)PD-1。PD-1與其兩個配體PD-L1和PD-L2結(jié)合，在免疫應(yīng)答中起著負(fù)性調(diào)控作用。為更好地了解PD-1分子在免疫調(diào)節(jié)中的作用，探討PD-1作用的分子機制，本研究擴增了人PD-1基因，構(gòu)建了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，篩選獲得了能穩(wěn)定高表達(dá)人PD-1分子的L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制備了抗人PD-1單克隆抗體，并對其生物學(xué)特性及對T細(xì)胞的影響進(jìn)行了初步探討。為進(jìn)一步研究PD-1／PD-L信號在免疫調(diào)節(jié)中的作用，在臨床腫瘤免疫、自身免疫性疾病以及移植免疫等疾病中的免疫干預(yù)，提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 1、人PD-1 基因的擴增、在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞PD-1／L929上的表達(dá)及其生物學(xué)功能的研究。采用PCR的方法，突變?nèi)薖D-1全長基因的PstI位點，從本室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-5X-3-PD-1中擴增出PD-1基因，并構(gòu)建含PD-1基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，最終轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)PD-1分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)D-1／L929，并探討了PD-1／L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞對Mo-DC成熟的影響。結(jié)果顯示，PD-1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以促進(jìn)DC的成熟，上調(diào)CD80和CD83的表達(dá)，但對CD86的作用不明顯。此實驗提示，PD-1／L929細(xì)胞可通過Mo-DC上的PD-L1分子產(chǎn)生逆向信號，從而介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。 2、鼠抗人PD-1單抗的研制及其生物學(xué)特性研究。應(yīng)用高表達(dá)人PD-1分子的PD-1／L929細(xì)胞為免疫原，常規(guī)方案免疫6～8周齡BALB／c小鼠。激發(fā)免疫后，將小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠SP2／0在PEG下融合，雜交瘤細(xì)胞經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)獲得。繼而以PD-1／L929為篩選細(xì)胞，采用間接免疫熒光試驗法，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測雜交瘤的培養(yǎng)上清中抗PD-1抗體的分泌。陽性克隆經(jīng)有限稀釋法多次亞克隆，至所有培養(yǎng)孔中的雜交瘤上清為陽性。實驗先后共融合80塊96孔板，篩選后最終獲取2株持
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 明志君;肖淑寧;陳永井;施勤;張學(xué)光;;人PD-1基因克隆及其在L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的表達(dá)[J];江蘇醫(yī)藥;2006年06期

本文編號：2800747