發(fā)布時(shí)間：2020-08-21 05:33

【摘要】： 過敏毒素C5a是補(bǔ)體活化、裂解的產(chǎn)物，具有黏附分子調(diào)節(jié)及免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，作為機(jī)體一種重要的前炎癥介質(zhì)，其參與了許多疾病的病理過程，并對這些疾病的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。因此，阻斷C5a與C5aR的結(jié)合，抑制C5a過敏毒素的生物學(xué)效應(yīng)，將對ALI、ARDS及其它C5a相關(guān)疾病的預(yù)防和治療起到積極的推動(dòng)作用。目前，這方面的研究主要集中在C5a單抗及C5a抗血清。本研究以正、反義肽的選擇性相互作用的理論為依據(jù)，從反義肽分子設(shè)計(jì)的角度尋找可中和C5a過敏毒素的拮抗多肽。 主要的研究內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面： (1)采用親水性方案、可塑性方案及可及性方案，對C5a與C5aR結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：C5a的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域主要位于氨基端第1～8位，核心區(qū)第28～39位及羧基端第65～70位的氨基酸殘基。 (2)根據(jù)上述C5a功能結(jié)構(gòu)區(qū)域的分析結(jié)果，結(jié)合Baranyi等關(guān)于C5a與C5aR分子間作用最強(qiáng)的反義同源盒區(qū)(LR3、LR4)序列，確定C5a分子兩個(gè)功能結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域在第28～40位和第61～74位，分別命名為正義肽L1和L2；按照反義肽分子設(shè)計(jì)的模型，設(shè)計(jì)并合成了對應(yīng)于上述兩條正義肽的共四條反義肽，具體序列如下： 正義肽L1：V~(28)NNDETCEQRAAR~(40)。其對應(yīng)的反義肽為： 反義肽R1：QLLLLWTLDARRA 反義肽R2：PCSSQLTGFIIIN 正義肽L2：L~(61)RANISHKDMQLGR~(74)其對應(yīng)的反義肽為： 反義肽R3：PSQLHVFMRDISTE 反義肽R4：EARLQRVFLYVNPS (3)采用生物分子相互作用分析(BIA)技術(shù)篩選可與csa發(fā)生選擇性相 互作用的反義多膚，并進(jìn)一步研究其分子間相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。結(jié)果 顯示:在上述4條反義膚中，只有一條反義膚(R4)與csa全長分子及正義 膚LZ間存在選擇性相互作用，其解離平衡常數(shù)值(Ko)分別為6.62K10一6M 和4 .508 x1O6M。 (4)通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究反義膚R4對Csa介導(dǎo)的VEC與P入IN粘 附的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)反義膚R4的濃度為1000 ng/ml時(shí)，勃附分子 P一Seleetin的表達(dá)同單純Csa刺激組相比出現(xiàn)顯著性差異，P一Seleetin表達(dá) 的陽性細(xì)胞率明顯降低;當(dāng)其濃度達(dá)so00ng/ml時(shí)，vEc上P一Selectin表 達(dá)量達(dá)最低，其表達(dá)量可下降20%左右;若進(jìn)一步增加R4的濃度， P一Selectin表達(dá)量再無明顯下降。同時(shí)，通過檢測VEC上豁附的PM…N中 MPO的活性，間接反映VEC與PNfN間豁附性的強(qiáng)弱，結(jié)果表明:當(dāng)反 義膚R4的濃度為1000ng/ml時(shí)，VEC上砧附pMN中MpO的活性同單純 csa刺激組相比出現(xiàn)顯著差異(P0.05);當(dāng)反義膚R4的濃度增加至500。 ng/ml，VEC一L勃附的PM刊數(shù)量最少，同單純Csa刺激組相比相差非常顯 著(P0.01)，其淤。的活性由1 .16Xlo，uzwell下降至o.71Xlo，u/well，降 低達(dá)40%左右。 (5)采用夾心ELI SA法，測定和比較正常人及發(fā)生AIJI后病人血清中 Csa的含量;通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測ALI病人血清作用后VEC表面戮附 分子:P選擇素(P一Selectin)和細(xì)胞間勃附分子(ICAM一l)的表達(dá)變化;同時(shí) 檢測了粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的PMN中MPO活性，以間接反映血管內(nèi) 皮細(xì)胞表面PMN的勃附和聚集。結(jié)果顯示:ALI病人血清中Csa含量明 顯升高，其平均值為47.2ng/Ml，同正常組比較相差非常顯著(P0.01);ALI 病人血_清刺激后血管內(nèi)皮細(xì)胞表面P一Selectin的表達(dá)迅速增加，20min達(dá)到 高峰，60min后開始降低;ICAM一1的表達(dá)較慢，3h開始升高，12h達(dá)到最 高值，24h內(nèi)無明顯下降，仍維持在較高水平;血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附的 PNIN中MPO的活性，3h明顯升高，12h后達(dá)到最高值。 結(jié)論:(1)根據(jù)對人Csa與CsaR結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行分析的結(jié)果， 結(jié)合Csa分子的二級結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為Csa與CsaR結(jié)合的主要功能結(jié)合位 點(diǎn)應(yīng)位于梭基端第61一74位和核心區(qū)域第28一40位氨基酸殘基。(2)采用 生物分子相互作用分析(BIA)技術(shù)證實(shí):按照反義肚分子設(shè)計(jì)的MBB模型， 設(shè)計(jì)、合成的Csa反義膚與Csa及其正義膚分子間確實(shí)存在選擇性相互作 用;篩選獲得一條可與Csa全長分子及正義膚LZ發(fā)生選擇性相互作用的 反義多膚(R4)，其與Csa分子間相互作用的解離平衡常數(shù)值(KD)為6.62X 10一6M，與其正義膚LZ分子間的丸為4.508xlo一6M，符合文獻(xiàn)報(bào)道的弱 親和力生物分子間相互作用的基本規(guī)律。(3)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:反義膚 R4可以劑量依賴關(guān)系拮抗Csa介導(dǎo)的VEC表面豁附分子P一Selectin的表 達(dá)，減少VEC上豁附PMN的數(shù)量，其拮抗效率在20%到40%之間。另 外，估計(jì)反義膚R4與Csa分子間的計(jì)量配比關(guān)系應(yīng)在2一10之間。其作 用的機(jī)制為:Csa反義膚選擇性結(jié)合于Csa，從而有效地阻斷Csa與CsaR 的結(jié)合，對Csa過敏毒素的生物學(xué)活性發(fā)揮拮抗作用。(4) ALI后由于Csa 含量的升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面豁附分子:P一Selectin和ICA人1一1等表達(dá)的 上調(diào)，致使大量PMN在肺微血管內(nèi)扣押、聚集進(jìn)而同肺血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā) 生粘附，促進(jìn)了ALI及ARDS的發(fā)生、發(fā)展。盡管八擊1的發(fā)生是諸多因素 在多個(gè)環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，但本研究的結(jié)果對于過敏毒素Csa在A工1形 成中的始動(dòng)因素地位機(jī)制是一個(gè)有力佐證，將有助于對ALI發(fā)病機(jī)理的闡 明，同時(shí)也為以補(bǔ)體Csa為靶向，
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2798994